K8·凯发(中国)

针对上述问题，南京医科大学胡克教授和张飞敏（音译）教授团队提出了一种基于普鲁士蓝纳米杂化多细胞球体（PBNPs@MCSs）的复合移植体，用于抗氧化骨再生和光声层析成像。该复合移植体顺利获得调节细胞基质的机械性能，引导多种细胞自组织形成多细胞球体（MCSs），并在形成过程中将普鲁士蓝纳米粒子（PBNPs）与MCSs杂化。这种纳米杂化多细胞球体不仅具有强大的抗氧化功能，能够有效减少细胞在氧化应激条件下的凋亡，还表现出增强的微环境调节能力和促进体内外骨修复的能力。此外，PBNPs@MCSs还展现出增强的光声成像能力，能够追踪低剂量的PBNPs。因此，基于仿生水凝胶构建的PBNPs@MCSs可以作为一种复合移植体的构建模块，在口腔复杂微环境中具有更大的促骨修复应用潜力。该文章于2024年08月09日以《Prussian Blue Nanohybridized Multicellular Spheroids as Composite Engraftment for Antioxidant Bone Regeneration and Photoacoustic Tomography》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.3c06835）。

研究示意图

（1）普鲁士蓝纳米粒子（PBNPs）和仿生水凝胶的表征

TEM和SEM观察普鲁士蓝纳米粒子（PBNPs）的形貌，发现PVP包覆的PBNPs呈立方体形状，直径约100纳米，粒径均匀，表面呈“颗粒状”（图S1A、B）。高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）图像清晰显示了纳米颗粒中分散的独特晶格和表面晶格条纹，表明PBNPs具有良好的结晶性（图S1D）。能量色散X射线光谱（EDX）确认PBNPs的元素组成为C、N、Fe和K，其中Fe元素含量最高（图S1E）。紫外-可见（UV-vis）吸收光谱显示PBNPs在约700纳米处有一个峰，归因于Fe(II)和Fe(III)之间的价电荷转移（图S2A）。PBNPs的流体动力学尺寸约为131纳米，平均zeta电位约为-21.8毫伏，表明其表面带负电（图S2B、C）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示PBNPs在2086厘米⁻¹处有一个主要峰，对应于Fe(II)-CN-Fe(III)键的-C≡N-伸缩振动（图S2D）。

图S1 普鲁士蓝纳米粒子（PBNPs）的表征。（A）PBNPs的透射电子显微镜（TEM）图像；（B）PBNPs的扫描电子显微镜（SEM）图像（100k倍）；（C）PBNPs的扫描电子显微镜（SEM）图像（500k倍）；（D）PBNPs表面晶格的高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）图像；（E）PBNPs的能量色散X射线光谱（EDX）元素分布图（黄色：Fe，蓝色：K，红色：N，绿色：C）

（2）PBNPs@MCSs的制备

图1展示了PBNPs@MCSs在水凝胶上的形成过程，顺利获得调节细胞基质力学性能引导细胞自组织形成MCSs，并实现其与PBNPs的杂化。图1D的ICP-MS实验结果表明，在MCSs（MC3T3-E1）中，PBNPs主要被包裹在球体内部，仅有少量被细胞吞噬。图1E显示，MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）直径均约为200微米，且呈完整球形，PBNPs@MCSs中心部分较暗，说明纳米粒子在球体内部稳定。图1F的免疫荧光染色结果表明，添加PBNPs未显著改变细胞间相互作用分子（如E-钙黏蛋白）的表达，也未影响MCSs的细胞骨架和形态，证实了该杂化体系的生物相容性。图1G描绘了MC3T3-E1细胞在水凝胶上自组织形成球体的时间演变：培养12小时后，细胞开始顺利获得分泌细胞外基质相互作用；1至5天内，细胞逐渐聚集形成多细胞团块，形状逐渐圆润，5天后形成分离的MCSs。这种在水凝胶上顺利获得细胞自主装载形成纳米杂化MCSs的方法，不依赖纳米粒子内化，提高了标记效率，减少了细胞损伤，且更具通用性，可标记内化能力低的细胞类型和纳米粒子，拓展了纳米杂化MCSs的功能。

图1 仿生水凝胶的表征。（A）仿生水凝胶的宏观照片；（B）仿生水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图像；（C）水凝胶的力学性能表征；（D）铁含量的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测试；（E）光学显微镜图像显示MC3T3-E1细胞形成的多细胞球体（MCSs）和普鲁士蓝纳米粒子杂化的多细胞球体（PBNPs@MCSs）；（F）顺利获得免疫荧光检测细胞黏附因子E-钙黏蛋白的表达；（G）在水凝胶上培养120小时后形成的MC3T3-E1细胞的MCSs以及与PBNPs共培养形成的PBNPs@MCSs

（3）PBNPs@MCSs的光声成像效果

图2A、B展示了不同浓度PBNP溶液（0、10、20、50、100、150和250微克/毫升）在700纳米近红外激光脉冲下的光声成像实验结果。PBNPs能够产生强烈的光声信号，且信号强度随浓度增加而增强，50微克/毫升浓度开始显示出明显效果。图2C、D显示了在细胞水平上，PBNPs（20微克/毫升）标记的细胞或MCSs与未标记的2D培养细胞对照组的光声成像结果。PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在2D和3D标记中均保留了PBNPs的光学特性，并且显示出更优越的光声成像能力。图2E顺利获得在BALB/c小鼠背部皮下注射PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）进行体内光声成像测试。超声图像（图2E左侧）显示了清晰的低回声腔，表明细胞溶液已成功注入小鼠背部。光声图像（图2E右侧）显示了不同组的成像效果，信号强度收集结果如图2F所示。在体内，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）组显示出比其他两组更好的光声成像效果。这些结果表明，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）具有光声示踪能力，可用于追踪植入物的位置、作用持续时间和残留量。

图2 光声成像相关研究。（A）不同浓度PBNP溶液的光声图像（从左到右，浓度逐渐增加）；（B）不同浓度PBNP溶液的光声信号强度；（C）PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在细胞水平的光声成像效果；（D）图C中不同组的光声信号强度；（E）在BALB/c小鼠背部皮下注射后PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的体内光声成像（左：超声图像，右：光声图像）；（F）图E中不同组的光声信号强度

（4）PBNPs@MCSs的抗氧化特性

在PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的抗氧化特性实验中，图3A显示PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）组的DCF荧光水平与MCSs（MC3T3-E1）组无显著差异，表明单独的PBNPs并未增加MCSs中的ROS水平；而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+Rosup组的DCF荧光水平显著低于MCSs（MC3T3-E1）+Rosup组，说明添加PBNPs能够增强MCSs的抗氧化水平。图3B的定量结果与图3A一致，进一步证实了PBNPs的抗氧化效果。图3C的活/死染色结果显示PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）组与MCSs（MC3T3-E1）组无显著差异，表明PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）具有良好的生物安全性。图3D表明，在400 μM H₂O₂刺激下，MCSs（MC3T3-E1）组的非凋亡细胞比例显著下降，坏死细胞比例上升，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）组的细胞存活率与未刺激的对照组相当，说明PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）能在高ROS环境中有效保护细胞免受凋亡和坏死。这些结果表明，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）不仅增强了细胞的抗氧化特性，还显著提高了细胞在氧化应激条件下的生存能力。

图3 氧化应激与细胞活性研究。（A）使用DCFH探针荧光染色的MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的荧光图像；（B）图A中不同组DCF荧光强度的定量分析；（C）用H₂O₂处理的MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的活/死荧光图像；（D）顺利获得流式细胞术检测MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在氧化环境中的抗凋亡能力

（5）成骨相关指标的检测

成骨诱导7天后，ALP染色（图4A）和活性测定（图4B）结果显示，在MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组中，成骨受到显著抑制，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组的成骨分化能力恢复到接近未受H₂O₂处理的MCSs（MC3T3-E1）组的水平。成骨诱导21天后，茜素红染色结果（图4C）显示，在MCSs（MC3T3-E1）组中可见大量红色钙结节，颜色最深，而MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组的茜素红染色最浅，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组介于两者之间。钙结节的半定量结果（图4D）与茜素红染色结果基本一致。此外，成骨相关基因RUNX-2、ALP、COL-I和OCN的mRNA表达水平的qRT-PCR结果如图4E所示。200 μM浓度的H₂O₂刺激显著抑制了成骨相关基因的mRNA表达，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）组的成骨相关基因表达水平与未受刺激的MCSs（MC3T3-E1）组相似。

图4 PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的体外抗氧化成骨能力。（A）2D培养细胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在成骨诱导7天后的碱性磷酸酶（ALP）染色代表性图像（4×）；（B）成骨诱导7天后2D培养细胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的ALP活性定量检测；（C）成骨诱导21天后2D培养细胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的茜素红染色代表性图像（10×）；（D）不同组钙结节的半定量检测；（E）成骨诱导7天后顺利获得qRT-PCR检测成骨相关基因

顺利获得免疫荧光染色观察各组成骨诱导7天后RUNX2蛋白的表达情况。RUNX2呈红色荧光，细胞骨架呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光；结果如图5所示。对照组为非球形细胞，细胞排列较为规整。然而，接种在共聚焦培养皿上的球形细胞向四周扩散，大量细胞骨架相互重叠。在200 μM H₂O₂刺激下，MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组中RUNX2+细胞显著减少，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H₂O₂组中RUNX2+细胞未显著减少。

图5 成骨诱导7天后，顺利获得免疫荧光染色检测2D培养细胞（MC3T3-E1）、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）中RUNX2蛋白的表达。RUNX2（红色）、鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）

(6)PBNPs@MCSs（rBMSCs）在体内清除ROS的能力检测

术后24小时使用小动物可见光成像系统收集DCF荧光图像并进行定量分析，结果显示拔牙手术创伤导致拔牙窝内ROS水平升高，而PBNPs@MCSs（rBMSCs）能有效清除ROS（图6B、C）。图6D展示了拔牙后第7天和第21天大鼠上颌第一磨牙的微CT矢状图像，术后7天，空白对照组拔牙区域存在较大低密度阴影，明胶海绵组有少量新骨形成，而PBNPs@细胞（rBMSCs）组和PBNPs@MCSs（rBMSCs）组显示出点状高密度阴影，但骨密度和骨量相对较低；术后21天，各组牙槽间隔萎缩消失，拔牙窝区有层状新骨形成，其中PBNPs@MCSs（rBMSCs）组骨量和骨密度最高。图6E、F的量化分析显示，空白对照组和海绵组之间无显著差异，而PBNPs@MCSs（rBMSCs）组在每个时间点结束时的骨密度（BMD）值和骨量/总体积（BV/TV）比值均显著高于对照组，且在21天时，PBNPs@细胞（rBMSCs）组和PBNPs@MCSs（rBMSCs）组之间出现显著差异，表明PBNPs@MCSs（rBMSCs）组在拔牙窝内具有更强的抗氧化能力和骨修复效果。

图6 体内动物实验及成骨效果评估。（A）体内动物实验示意图；（B）手术后24小时，顺利获得小动物可见光成像系统收集的提取窝点的DCF荧光图像；（C）DCF荧光强度的定量结果；（D）牙齿拔除后7天和21天大鼠上颌第一磨牙的代表性微CT矢状图像；（E）骨密度（BMD）的微CT定量分析结果；（F）骨体积/总体积（BV/TV）的微CT定量分析结果；（G）用Masson三色染色的骨缺损标本的代表性图像

随后，顺利获得Masson三色染色（图6G）、Goldner三色染色（图7A）和von Kossa染色（图7B），结果显示PBNPs@MCSs（rBMSCs）组有更好的新骨形成和矿化，组织形态计量学分析也表明该组有显著更高的矿化骨体积和阳性染色胶原蛋白（图7C、D），进一步证实了PBNPs@MCSs的原位骨再生潜力。

图7 手术后第7天和第21天牙槽骨缺损的组织学变化。（A）用Goldner三色染色的骨缺损标本的代表性图像（黑条：1 mm（20×）和0.5 mm（40×））；（B）用von Kossa染色的骨缺损标本的代表性图像（黑条：1 mm（20×）和0.5 mm（40×））；（C）Goldner三色染色结果的统计分析（阳性面积/总面积）；（D）von Kossa染色结果的统计分析（阳性面积/总面积）