K8·凯发(中国)

针对上述问题，山东大学林贵梅教授团队提出了一种新的概念设计，开发了一种具有仿生表面的可吸入纳米颗粒，该纳米颗粒采用体内工程外泌体为基础的siRNA递送策略，用于治疗伴有脑转移的非小细胞肺癌（NSCLC）患者。当这些纳米颗粒被吸入时，它们能有效穿透肺部屏障，并顺利获得模仿天然肺表面活性物质在肺部积聚，在肿瘤细胞内，释放的奥希替尼能够抑制肿瘤生长，而DNA则会触发工程外泌体的生成，这些外泌体可以到达大脑，进一步抑制肿瘤。这一策略不仅有效抑制了原发性和转移性肿瘤，还增强了抗肿瘤免疫反应。顺利获得高效的吸入给药策略，该纳米药物为癌症治疗给予了一种安全且多功能的解决方案。该文章于2025年4月8日以《Inhalable liposomal delivery of osimertinib and DNA for treating primary and metastasis lung cancer》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-58312-5）。

图1. MPDOLs治疗NSCLC原发性肺肿瘤及脑转移的示意图

（1）NSCLC中IGF2BP3的表达

利用癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析了非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤组织中m6A修饰因子的表达情况（图2a）。在这些修饰因子中，IGF2BP3是与转移性肿瘤相比原发性肿瘤上调最为显著的m6A相关基因之一（图2b）。进一步利用基因表达分析交互工具（GEPIA）验证了IGF2BP3在两种肺肿瘤中的高表达及其与预后不良的相关性（图2c、d）。与这些生物信息学分析结果一致，NSCLC患者肺肿瘤组织中IGF2BP3蛋白水平远高于邻近组织（图2e、f）。此外，免疫组化证据和定量实时PCR（qRT-PCR）检测结果显示，在NSCLC小鼠模型的脑转移区域，IGF2BP3表达水平升高（图2g、h）。长期使用奥希替尼（OST，5 mg/kg）部分减轻了肿瘤负担，但也轻微上调了IGF2BP3的表达，这与近期报道IGF2BP3介导非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗药物耐受性的研究结果一致（图2i）。在正常LLC细胞中，经过长期OST刺激后IGF2BP3的mRNA表达水平增加（图2i）。这些发现表明，靶向IGF2BP3可能增强肿瘤细胞对OST的敏感性，并抑制NSCLC治疗中的脑转移。由于现在没有可用的IGF2BP3小分子抑制剂，设计并筛选了siRNA序列（正义链：GCCGUCUCAUUGGUAAAGATT，反义链：UCUUUACCAAUGAGACGGCTT），以实现对IGF2BP3的有效干扰（图2j、k）

图2. a. 基于TCGA数据库分析的正常和NSCLC组织中m6A修饰因子基因的表达分布。b. 使用TCGA数据对有无转移的NSCLC中m6A调节因子的分子特征进行分析。c. 在GEPIA数据库中人类NSCLC的IGF2BP3基因表达分析。d. GEPIA数据库中IGF2BP3表达与NSCLC患者生存率的相关性分析。e. 人类NSCLC组织和邻近组织中IGF2BP3蛋白的免疫组化染色及f. 定量分析。g. NSCLC小鼠模型组织的IGF2BP3蛋白免疫组化染色。h. 小鼠NSCLC和正常组织中IGF2BP3 mRNA水平的qRT-PCR分析。i. LLC细胞经OST和IGF2BP3 siRNA处理后IGF2BP3 mRNA水平的qRT-PCR分析及j. k. IGF2BP3蛋白水平的Western blot分析

（2）MPDOLs的制备和表征

顺利获得迈克尔加成反应合成PβAE以与质粒DNA复合形成内核（PD）。在不同的重量比（1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1和40:1）下构建了PD纳米颗粒，以评估PβAE与质粒DNA的复合能力。琼脂糖凝胶电泳结果表明，当重量比至少为10:1时，质粒DNA可以被完全复合（图3b）。在此重量比下，PD纳米颗粒的平均尺寸为50.47 ± 5.36 nm，呈正电荷的zeta电位为26.97 ± 3.85 mV，且呈球形（图3c）。同时，顺利获得薄膜分散法制备了包裹OST的脂质外壳。得到的OST脂质体（OLs）的平均尺寸为141.47 ± 3.07 nm，zeta电位为6.65 ± 0.37 mV。随后，将PD颗粒加入等体积的OLs中形成PDOLs，其平均尺寸为182.63 ± 6.04 nm（图3c）。此外，利用慢病毒转染建立稳定表达SP-B蛋白的MSC细胞系，并在转染后48小时顺利获得GFP荧光检测到明显信号（图3d）。经过7天的嘌呤霉素处理筛选稳定克隆后，顺利获得Western blot实验确认了SP-B的高表达（图3e）。在用细胞膜包被后，得到的MPDOLs尺寸略有增加，为195.20 ± 4.56 nm，zeta电位从6.74 mV变为−4.28 mV。顺利获得荧光共振能量转移（FRET）实验进一步验证了MSC膜与脂质体的融合。当MSC膜和脂质体靠近融合时，脂质体中的DiO吸收波长顺利获得能量共振激发膜中的Dil荧光团，这导致荧光特征光谱发生变化，包括DiO发射荧光减弱和Dil发射荧光出现（图3f）。蛋白质组学分析进一步验证了MPDOLs中膜蛋白的保留（图3g）。评估了在两种不同pH下模拟正常生理条件和肿瘤细胞的酸性环境时OST的释放特性，包载在脂质体中的OST在pH=7.4时显示出较慢的释放特性，释放过程持续数天，在pH=5.0时，MPDOLs中的OST在12小时内释放了79.85%，表明MPDOLs能够在肿瘤细胞的内体溶酶体中快速释放药物（图3h）。

为了研究MPDOLs的体内分布，分别对小鼠给予游离DiR、DiR标记的PDOLs或DiR标记的MPDOLs，并使用活体成像系统在24小时内监测其荧光分布情况。与游离DiR组相比，MPDOLs处理组小鼠肺部的荧光强度约为游离DiR组的两倍（图3i、j）。MPDOLs处理组中，肺部的荧光强度在吸入后12小时达到峰值，随后逐渐下降（图3i）。顺利获得对肺组织切片进行荧光显微镜检查，进一步证实了MPDOLs的增强穿透和保留能力，与PDOLs相比，其在细支气管和肺泡中的积累更高（图3k）。鉴于肺部肿瘤微环境的复杂性，该微环境由多种细胞、细胞外基质和分泌物组成，顺利获得流式细胞术研究了摄取MPDOLs的主要细胞群。结果表明，MPDOLs主要定位于CD45−恶性细胞，占总细胞群的约70%，其次是占20%的巨噬细胞（图3l）。这些发现表明，MPDOLs能够有效穿透肺组织，并主要被恶性细胞内化，显示出其增强肺部药物递送的潜力。

图3.a. MPDOLs制备过程的示意图。b. 不同重量比下PβAE与质粒DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳图。c. PDs、OLs、PDOLs和MPDOLs的粒径分布和形态图像。d. LV-Sftpb转染MSCs后48小时的荧光显微镜图像e. Western blot分析确认SP-B在SP-B+MSC细胞中的高表达。f. 由Dil标记的膜和DiO标记的脂质体在MPDOLs中产生的FRET对的发射光谱。g. MPDOLs中膜蛋白的SDS-PAGE分析。h. 在两种不同pH环境中MPDOLs中OST的释放动力学。i. 经雾化吸入后，LLC肿瘤小鼠的代表性活体成像图，j. 主要器官中荧光辐射效率的定量分析。k. 经雾化吸入后，小鼠肺组织切片的免疫荧光图像。l. 流式细胞术分析显示肺组织中总细胞中摄取MPDOLs的细胞百分比

（3）MPDOLs在体外的生物学效应

顺利获得用香豆素6（C6）标记脂质层来研究LLC细胞对MPDOLs的摄取。流式细胞术分析和共聚焦显微镜结果均显示，MPDOL处理组随时间推移呈现出依赖时间的荧光信号。与C6组相比，FITC的平均荧光强度更高，表明细胞摄取能力增强（图4b、c）。随后使用不同的内吞抑制剂来确定LLC细胞中MPDOLs的内化途径。结果表明，氯丙嗪（CPZ）和大豆素（GEN）能够抑制细胞内平均荧光强度，而甲基-β-环糊精（m-β-CD）和阿米洛利氢氯酸盐（AM）则无此效果，这表明MPDOLs主要顺利获得网格蛋白和洞穴体介导的内吞作用进入细胞（图4d）。在网格蛋白和洞穴体介导的内吞作用中，溶酶体逃逸是影响纳米药物亚细胞生物利用度的关键步骤。使用LysoTracker标记内体-溶酶体，并顺利获得共聚焦显微镜观察GFP标记的MPDOLs。孵育4-8小时后，GFP信号大多被困在溶酶体中，随着时间推移，共定位减少，GFP信号逐渐扩散到细胞质中，表明成功实现了溶酶体逃逸（图4e）。可以从几个方面来解释这一现象。释放实验表明，内体-溶酶体的酸性环境触发了MPDOLs的破裂，并促进了OST和PDs的释放。为进一步证实这一点，用MPDOLs孵育的LLC细胞经吖啶橙染色后，与对照组相比，显示出明显的溶酶体膜通透性增加（图4f）。

在LLC细胞中，MPDOLs对IGF2BP3表达的下调作用以及诱导细胞毒性能力的评估结果显示，MPDOLs和PDs均能显著下调IGF2BP3的表达水平。顺利获得qPCR和Western blot分析，K8·凯发(中国)发现MPDOLs和PDs均能有效降低IGF2BP3的mRNA和蛋白表达水平（图4g、h）。细胞毒性实验表明，MPDOLs的半数抑制浓度（IC50）为1.23 μM，低于单独使用OST（2.03 μM）和PDs（2.36 μM）的IC50值（图4i）。此外，顺利获得流式细胞仪检测Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色的细胞凋亡情况，MPDOL处理组在48小时后显示出最高的凋亡率，占总细胞群体的17.6%（图4j）。这些结果表明，MPDOLs能够有效地将OST和DNA递送至肿瘤细胞的细胞质中，进而下调IGF2BP3的表达，并抑制LLC细胞的生长。

图4.a. MPDOLs在LLC细胞中的细胞摄取及其在外泌体产生中的作用。b. 流式细胞术分析和c. 定量分析LLC细胞摄取C6标记的MPDOLs的平均荧光强度。d. 不同内吞抑制剂对LLC细胞摄取MPDOLs的影响。e. 不同时间LLC细胞中MPDOLs的溶酶体逃逸图像。f. 用MPDOLs处理的LLC细胞的吖啶橙染色。g. qRT-PCR分析LLC细胞中IGF2BP3 mRNA水平和h. Western blot分析LLC细胞中IGF2BP3蛋白表达，经不同制剂处理。i. 不同s处理48小时后LLC细胞的细胞活力。j. 不同处理48小时后LLC细胞的总凋亡率，顺利获得流式细胞术测量

（4）来自细胞培养上清液的RVG-EXOs（si）的表征和生物学效应

顺利获得MPDOLs转染是否能够指导siRNA装载到外泌体中。在用MPDOLs转染LLC细胞后，收集细胞培养上清液以提取外泌体，这些外泌体被命名为RVG-EXOs（si）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，外泌体的平均直径为132.5 ± 4.6 nm，形态学特征显示其呈扁平圆盘状结构，具有特征性的脂质双层（图5a、b）。顺利获得Western blot检测到热休克蛋白70（HSP70）和ALIX这两种特异性外泌体标记物（图5c）。在用含有Flag标签质粒的MPDOLs转染LLC细胞后，观察到从细胞培养上清液中提取的外泌体中Flag的富集，这证实了指导蛋白的表达。此外，ALIX条带在各样本中的相似密度表明外泌体的产生水平一致（图5d）。顺利获得PCR分析证实，与未转染的细胞相比，经MPDOLs转染的细胞产生的外泌体中IGF2BP3 siRNA含量增加（图5e）。当LLC细胞与分离的RVG-EXOs（si）（总蛋白浓度为5 μg/mL）共孵育时，IGF2BP3的mRNA和蛋白水平均被敲低（图5f）。进一步研究了RVG-EXOs(si)在体外的治疗效果。RVG-EXOs（si）表现出剂量依赖性的细胞毒性，而正常LLC细胞上清液中分离的对照外泌体（EXOs）对癌细胞生长几乎没有影响，这表明RVG-EXOs（si）能够有效装载IGF2BP3 siRNA并保留其生物学功能（图5g）。为了评估RVG-EXOs（si）穿越血脑屏障（BBB）的能力，构建了体外BBB模型，使用bEnd.3细胞形成紧密连接（图5h）。将Dil标记的RVG-EXOs（si）加入到Transwell系统的上室（图5h）中。顺利获得显微镜图像和LLC细胞下室中的荧光强度确认RVG增强了外泌体穿越BBB的能力（图5i、j）。随后，还研究了体内或体外产生的RVG-EXOs(si)的组织靶向能力。在给药后12小时对主要器官进行成像，与普通EXOs相比，由基因工程化肿瘤细胞产生的RVG-EXOs（si）在脑组织中显示出显著更高的荧光信号，而在肝脏中的积累较少（图5k、l）。

图5.a.RVG-EXOs（si）的粒径分布，b. 形态学特征。c. Western blot分析RVG-EXOs（si）中外泌体标记物ALIX和HSP70，以及d. 用含有RVG-CD63-Flag融合质粒的MPDOLs转染后外泌体中Flag的表达。e. RVG-EXOs（si）中相对IGF2BP3 siRNA含量。f. qRT-PCR分析LLC细胞中IGF2BP3 mRNA水平。g. RVG-EXOs（si）或EXOs处理48小时后LLC细胞的细胞活力。h. 用于评估RVG-EXOs（si）穿越血脑屏障（BBB）能力的Transwell系统的示意图。i. 经RVG-EXOs（si）处理后下室中LLC细胞的代表性荧光图像和j. 荧光强度定量分析。k. 尾静脉注射游离DiD、DiD标记的EXOs和DiD标记的RVG-EXOs（si）后12小时，主要器官的离体成像和l. 主要器官中DiD的荧光强度定量分析

（5）MPDOLs在体内的治疗效果

为了评估MPDOLs的体内抗肿瘤疗效，K8·凯发(中国)建立了C57BL/6J小鼠的原位和脑转移肺癌肿瘤模型，使用表达荧光素酶的LLC细胞（LLC-Luc）。MPDOLs、PDOLs、PDs、OLs和磷酸盐缓冲液（PBS）顺利获得雾化吸入给药，每4天给药一次，共5次，而奥希替尼（OST）则顺利获得灌胃给药（图6a）。每3天记录一次小鼠体重，并顺利获得生物发光成像每周监测一次肿瘤进展（图6b）。PBS组的生物发光信号迅速增加，第21天后体重显著下降，表明肿瘤进展（图6b、c）。游离OST显示出极小的治疗效果，而OLs和PDs对肿瘤抑制效果有限。相比之下，MPDOL吸入显著抑制了肿瘤生长并延长了生存期。接受MPDOL治疗的小鼠生存期最长，70天时仍有80%存活，突显了其卓越的治疗效果（图6d）。在第28天，顺利获得微计算机断层扫描（micro-CT）观察到肺部肿瘤负荷减少，随后每组处死8只小鼠进行进一步分析。他们的血液样本、肺组织、脑组织和其他重要器官被取出，用于流式细胞术、细胞因子测定和组织学评估（HE）。Micro-CT显示MPDOL组肺部肿瘤负荷减少，肺密度降低，湿重较PBS和OST组减轻（图6e、f）。离体生物发光成像进一步显示MPDOL治疗组肺部和脑部肿瘤负荷减少。虽然OLs主要减轻了肺部肿瘤负荷，但PDs对脑转移瘤的疗效更为显著（图6g、h以及补充图17）。这表明顺利获得DNA质粒在体内产生的外泌体有望用于治疗远处肿瘤。在脑转移模型中，PBS处理的小鼠表现出较大的肿瘤负荷，而MPDOL治疗几乎将脑转移瘤抑制到难以检测的水平（图6i）。

图6.a. 吸入治疗的实验时间表。b. 小鼠肺部和脑部肿瘤的活体生物发光成像。c. 小鼠体重变化和d. 每个治疗组的生存曲线。e. 顺利获得CT成像分析的平均肺密度和f. 第28天治疗后隔离的肺重量。g. 第28天治疗后肺部和h. 脑部肿瘤细胞的离体生物发光成像。i. 不同处理小鼠脑组织切片的代表性HE染色图像

（6）MPDOLs介导的体内抗肿瘤免疫反应

MPDOLs治疗对原位肺肿瘤微环境的免疫调节效应进行了系统评估。MPDOLs治疗显著增加了CD8+ T细胞的比例（图7a）。与CD8+ T细胞介导的肿瘤细胞杀伤相关的干扰素-γ（IFN-γ）水平升高，而调节性T细胞（Tregs）在抗肿瘤免疫抑制中发挥着重要作用。值得注意的是，MPDOL治疗使Tregs的百分比降低了三倍，并将IFN-γ+CD8+ T细胞的比例从PBS组的2.16%提高到9.16%（图7b、c）。MPDOL组中自然杀伤（NK）细胞的比例增加，进一步促进了抗肿瘤免疫反应（图7d）。肿瘤免疫微环境还表现为M2型巨噬细胞比例减少，促炎性M1型巨噬细胞比例增加，这可能归因于IGF2BP3的敲除，与之前的发现一致（图7e、f）。顺利获得酶联免疫吸附试验（ELISA）进行的细胞因子分析显示，与PBS组相比，MPDOL治疗组的血清中IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平显著升高，而白细胞介素-6（IL-6）、转化生长因子-β1（TGFβ1）和白细胞介素-10（IL-10）水平降低（图7g）。上述结果表明，MPDOL治疗激发了抗肿瘤免疫反应，并最终促进了针对肿瘤细胞的细胞毒性免疫效应。

图7.a. 流式细胞术和定量分析显示不同治疗后肺部肿瘤微环境中CD8+ T细胞的比例。b. 细胞毒性T细胞、c. Treg细胞和d. NK细胞的比例。e. 定量分析肺部肿瘤微环境中M2型巨噬细胞和f. M1型巨噬细胞的比例。g. 血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10和TGF-β1的相对细胞因子水平

（7）MPDOLs介导的抗肿瘤机制

为了进一步阐明MPDOLs对LLC细胞的治疗机制，进行了转录组分析。RNA测序鉴定了1203个差异表达基因（DEGs）（|log2(倍数变化)| > 1，p < 0.05），其中597个下调，606个上调（图8a），基因本体（GO）富集分析显示，下调基因与细胞增殖、细胞侵袭、DNA损伤修复以及癌症相关生物过程和通路相关。随后，KEGG通路富集分析突出了观察到的生物学效应所涉及的通路，与对照组相比，MPDOL处理组显著富集了细胞因子-细胞因子受体相互作用（30个DEGs）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（38个DEGs）（图8b）。为了研究潜在的相互作用和中心枢纽基因，将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络数据导入Cytoscape软件，取自五个cytoHubba算法（MNC、EPC、Degree、Closeness和BottleNeck）的前十个基因的交集。如图8c所示，Vegfa、Jund、Kdr、Ptgs2、Fos和Myc被鉴定为枢纽基因，与对照组相比，MPDOLs处理组中这些基因表达下调。其中，Myc、Fos和Ptgs2的|log2(倍数变化)|值超过2，而Vegfa、Jund和Kdr的|log2(倍数变化)|值大于1（图8a）。Myc在这些基因中具有最高的绝对丰度。为了进一步探索Myc的作用，分析了LLC细胞中其蛋白水平。结果显示，MPDOLs下调了Myc的蛋白表达（图8d）。据报道，大多数肿瘤细胞依赖于糖酵解，通常称为Warburg效应，作为糖酵解的关键调节因子，Myc顺利获得促进葡萄糖氧化为丙酮酸影响代谢过程，产生两个ATP分子，并促进氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）向还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的转化。在MPDOL处理后对LLC细胞中的几种糖酵解相关代谢物进行了定量分析。结果显示，葡萄糖摄取和乳酸产生（糖酵解的终产物）显著减少（图8e、f）。此外，观察到MPDOL组中NAD+水平增加（图8g）。从机制上讲，K8·凯发(中国)发现糖酵解的两个限速酶—葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）的表达下调，这可能是Warburg效应受到影响的原因（图8h、i）。此外，肿瘤微环境中的乳酸含量通常会影响抗肿瘤免疫调节，这也与体内抗肿瘤免疫反应的结果相辅相成（图8j）。

图8.a. 火山图显示与对照组相比，MPDOL治疗组LLC细胞中差异表达基因的情况。b. 顺利获得KEGG功能富集分析确定MPDOL组中前20个显著调控的通路。c. 顺利获得PPI分析使用5种算法确定的前10个中心枢纽基因。d. Western blot分析LLC细胞中Myc蛋白表达。e. 不同处理后LLC细胞的葡萄糖消耗量，f. 乳酸浓度和g. NAD+水平。h. 经不同处理后LLC细胞中HK2的免疫荧光染色和i. GLUT1。j. 提出的MPDOL治疗协同机制的示意图