K8·凯发(中国)

针对上述问题，温州医科大学张洪波、复旦大学附属肿瘤医院周世崇/常才团队制备了一种共载青蒿琥酯（ARS）和吲哚青绿（ICG）的仿生低密度脂蛋白（LDL），并将其与氨基乙基茴香酰胺（AEAA）偶联，以特异性抑制TNBC中的ECM CAFs和癌细胞。顺利获得空间转录组测序和空间代谢组测序，评估了ECM CAFs在TNBC光热治疗耐受性中的作用，并进一步研究了ARS如何调节CAFs细胞中的丝氨酸稳态和MAPK通路中GTP酶的活性。本研究揭示了限制ICG介导光热治疗在临床试验中疗效的关键原因，为有效治疗TNBC并有助于光热治疗的临床转化给予了新的思路。该文章于2025年6月17日以《Artesunate Nanoplatform Targets the Serine–MAPK Axis in Cancer-Associated Fibroblasts to Reverse Photothermal Resistance in Triple-Negative Breast Cancer》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI:10.1002/adma.202502617）。

研究示意图

（1）CAF参与肿瘤对PTT的耐药性

为探究不同细胞群HSP表达情况，对公开的单细胞RNA测序数据进行了再分析，结果显示CAFs的HSP mRNA水平高于其他细胞群，提示其具有更强的耐热性（图1A）。在Balb/c裸鼠模型中，评估了游离ICG介导的PTT效果：共植入CAFs和MDA-MB-231细胞的小鼠对治疗反应较弱（图1B）。此外，Eo771肿瘤模型中，游离ICG介导的PTT后ECM CAFs标志物表达显著升高（图1C）。综上，CAFs，尤其是ECM CAFs，在TNBC对PTT的耐受性中具有关键作用。结果显示，PLGA负载ARS可下调两种CAF亚型中Atf4的表达（图1D）。为进一步增强PTT敏感性，构建了以低密度脂蛋白（LDL）为载体的ARS递送系统（aLDL@A），并顺利获得茴香酰胺（A-aLDL@A）及吲哚青绿（ICG）（AI-aLDL@A）进行表面修饰（图1E）。该系统利用PEG2000连接剂，其一端与DSPE结合嵌入载体内，另一端的AEAA暴露在外，实现对高表达sigma-1受体的CAFs的靶向，同时ICG分子也位于纳米颗粒表面，有助于激光诱导的光热治疗。由于apoB-100骨架的存在，aLDL还具有对TNBC细胞的亲和力，因此该平台可双重靶向CAFs与TNBC细胞。所得纳米平台为球形，粒径约60 nm（图1F），LDL修饰后无显著尺寸变化，具良好水溶性和24小时内稳定性（图1G）。UV光谱验证了ICG与ARS纳米平台的成功偶联（图1H）。体外靶向实验表明，AI-aLDL对人CAFs、人乳腺癌细胞、小鼠成纤维细胞及TNBC细胞均具有良好的亲和力（图1I）。体内研究进一步证实，AI-aLDL在人CAF和MDA-MB-231细胞共植入模型中积累更多（图1J），显示出良好的CAF靶向能力。综上，该ARS纳米平台具备优异的CAF与TNBC双靶向性能，可介导PTT诱导的细胞杀伤，并抑制IL-6分泌。

图1 光热治疗耐药性研究及青蒿琥酯纳米平台的表征。（A） 不同细胞群中热休克蛋白mRNA表达水平的单细胞RNA测序数据；（B） PTT治疗后第6天对照组和纤维化组肿瘤重量的比较；（C） 免疫印迹法评估对照组和ICG介导PTT处理组织中ECM CAF标志物表达水平；（D） 对照组、PD-1单抗组和联合治疗组中ECM CAFs和伤口愈合CAFs的ATF4表达；（E） 双靶向青蒿琥酯纳米平台结构示意图；（F） LDL@A和AI-aLDL@A的FESEM图像；（G） 不同时间点LDL@A和AI-aLDL@A的水合尺寸；（H） AI-aLDL@A、A-aLDL@A和游离ICG的紫外吸光度光谱；（I） 顺利获得激光共聚焦显微镜评估AI-aLDL对CAFs和TNBC细胞的靶向性；（J） 静脉注射48小时内小鼠的代表性荧光图像及两侧肿瘤荧光强度的定量分析

（2）ARS 纳米平台可使 TNBC 细胞对 ICG 介导的 PTT敏感性

在多种三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中验证了ARS纳米平台的治疗效果（图2A）。在人源TNBC异种移植瘤模型中，该平台显著抑制肿瘤生长（图2B, C），证实其顺利获得特异性抑制ECM型癌相关成纤维细胞（CAFs）可增强光热治疗（PTT）疗效。与单独PTT组（I-LDL+L）相比，联合治疗组肿瘤组织中应激相关蛋白（HSP70、Ras、JNK和RhoA）表达水平降低（图2D），JNK表达亦明显下降（图2E），提示ARS可缓解PTT诱导的肿瘤应激。在Eo771 TNBC模型中，ARS平台再次显示出良好的治疗效果，并显著抑制JNK表达（图2F, G）。免疫荧光结果显示，PTT可引发ECM CAFs增加及ATF4上调，而ARS干预有效缓解这一现象（图2H, I）。此外，血清炎症因子检测表明，ARS可减轻PTT引发的炎症风暴和相关纤维化（图2J）。联合治疗还显著下调TNC与MYLK的表达（图2K），进一步证实ARS顺利获得缓解CAF应激状态提升PTT敏感性，其设计策略具有显著优势。

图2 青蒿琥酯纳米平台在多种TNBC模型中缓解PTT后应激反应的表征。（A）体内实验示意图；（B）MDA-MB-231模型中纳米药物处理后的肿瘤反应曲线；（C）MDA-MB-468模型中纳米药物处理后的肿瘤反应曲线；（D）I-LDL+L和I-LDL@A+L组小鼠肿瘤组织中HSP70、JNK、RhoA和Ras的表达；（E）小鼠肿瘤组织中JNK表达的免疫组化图像；（F）Eo771小鼠肿瘤模型中纳米药物处理后的肿瘤反应曲线；（G）不同组小鼠肿瘤组织中应激相关蛋白的表达；（H）肿瘤组织中TNC和MYLK表达分布的代表性免疫荧光图像；（I）控制组和I-LDL+L组小鼠组织中ATF4表达的免疫印迹；（J）不同组小鼠治疗后血清中炎症因子的浓度；（K）不同组Eo771肿瘤中TNC的免疫荧光强度定量结果

（3）基于空间转录组分析ECM CAFs形成的组织抗性屏障与PTT抗性关系

在I-LDL+L组中，肿瘤边缘CAFs与巨噬细胞标志物高表达且共定位，提示由ECM CAFs与浆液样巨噬细胞形成了类似免疫屏障的组织阻力结构，而联合治疗（I-LDL@A+L）显著削弱了该屏障（图3A）。顺利获得分析SPP1通路发现，M2型巨噬细胞与ECM CAFs及伤口愈合CAFs存在强相互作用，尤以ECM CAFs为主（图3B）。单细胞RNA测序和空间转录组进一步证实ECM CAFs与浆液样巨噬细胞间存在紧密互作及空间共定位（图3C, D），多重免疫荧光的共表达结果也进一步验证了这一发现（图3E, F）。此外，联合治疗可下调血管附近区域（0–40 μm）ATF4表达（图3G），表明ARS可缓解肿瘤应激，减轻纤维化。IL-6/STAT3信号通路分析也显示ECM CAFs与浆液样巨噬细胞在该通路中相互作用（图3H），提示ARS顺利获得干预该通路削弱二者联动，进而减少组织阻力屏障形成。MDA-MB-231模型中TNC和MYLK水平的降低进一步验证了ARS对ECM CAFs的抑制作用（图3I）。综上，ARS纳米平台顺利获得干预ECM CAFs与浆液样巨噬细胞的相互作用，有效削弱了肿瘤组织中的物理与免疫屏障。

图3 ECM CAFs在PTT耐药作用。（A）不同细胞类型的空间分布预测及空间映射；（B）SPP1信号通路中不同CAF亚型与巨噬细胞的相互作用强度；（C）ECM CAFs和伤口愈合CAFs与各种TAM亚型的相互作用强度；（D）不同组肿瘤组织的H&E染色图像及ECM CAFs和浆细胞样巨噬细胞的空间分布预测；（E）I-LDL+Laser组肿瘤组织中SPP1和TNC分布的多重免疫荧光评估；（F） 不同巨噬细胞亚型和CAF亚型中TNC和SPP1表达的点图；（G）ATF4基因表达水平与选定肿瘤血管区域距离的关系；（H）IL-6信号通路中ECM CAFs、伤口愈合CAFs与各种TAM亚型的相互作用强度；（I）不同组MDA-MB-231肿瘤中TNC的免疫荧光强度定量结果

（4）丝氨酸代谢在ECM CAFs中更活跃

ATF4是CAFs应激的重要标志物，也参与调控丝氨酸合成关键酶的表达。基于CAF亚型的转录特征分析发现，ECM CAFs在氨基糖、核糖核苷酸代谢、TCA循环和磷酸戊糖途径中显著富集（图4A）。空间代谢组分析显示，与对照相比，A-aLDL@A组肿瘤组织中尿苷5'-单磷酸、鸟苷单磷酸和尿嘧啶含量下降（图4B），而这些代谢物在ECM CAFs中表达水平高于其他区域，提示其代谢活性强（图4C）。此外，ECM CAFs在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路中高度活跃（图4D），提示丝氨酸代谢是其潜在靶点。尽管ECM CAFs与浆液样巨噬细胞的代谢伪时间轨迹相似（图4E），但在胆碱、胸腺嘧啶等代谢物含量上，ECM CAFs明显更高（图4F），进一步支持其代谢特异性。代谢通路富集分析亦显示，A-aLDL@A处理后，肿瘤组织中丝氨酸和胆碱通路受到显著调控（图4G）。综上，ARS纳米平台顺利获得干预丝氨酸代谢，有效抑制ECM CAFs的代谢活性，为其靶向治疗给予新策略。

图4 ECM CAFs与丝氨酸代谢高度相关。（A）基于单细胞RNA测序的基因表达预测不同CAF亚型在各种代谢途径中的表达水平；（B）对照组和A-aLDL@A组肿瘤组织中代表性代谢物（核苷酸）的空间映射；（C）ECM CAF区域与其他区域中尿苷5'-单磷酸（嘧啶核苷酸）和胆碱（一碳单位）表达水平的比较；（D）基于ECM CAF区域与其他区域代谢物表达的代谢途径富集分析；（E）ECM CAFs和浆细胞样巨噬细胞中代谢物强度分布的伪时间分析；（F）ECM CAFs和浆细胞样巨噬细胞中胆碱、胸腺嘧啶及代谢物表达水平的比较；（G）基于对照组和A-aLDL@A组所有代谢物表达的前10个富集代谢途径

（5）ARS纳米平台抑制CAFs中的MAPK级联反应和丝氨酸稳态

为阐明ARS纳米平台逆转光热治疗（PTT）抗性的机制（图5A），对对照组与A-aLDL@A治疗组肿瘤组织进行转录组、蛋白质组及代谢组联合分析。结果显示，ECM CAFs中MAPK通路活性显著高于其他亚型（图5B），而ARS处理后MAPK通路相关基因和蛋白表达明显下调（图S14A，支持信息；图5C）。同时，ARS还显著抑制一碳代谢通路，提示其可联合干预ECM CAFs中的MAPK级联与丝氨酸代谢。进一步研究发现，丝氨酸耗竭可导致MAPK通路相关基因在蛋白水平下降、转录水平补偿性升高（图5D, E），可能与翻译后修饰障碍有关。此外，丝氨酸耗竭显著影响线粒体功能，导致其内丝氨酸积累（图5F）。利用^13C标记示踪，发现丝氨酸耗竭后，^13C标记蛋白主要富集于核苷酸代谢、CoA活性与GTP酶相关路径（图5G），提示其顺利获得干扰能量代谢和GTP酶活性，进而抑制CAFs中MAPK信号传导。综上，ARS纳米平台顺利获得靶向丝氨酸代谢干扰MAPK通路，有效逆转CAFs介导的PTT耐受。

图5 CAFs中丝氨酸调控MAPK通路的机制。（A）青蒿琥酯纳米平台在CAFs中的调控机制示意图；（B）不同CAF亚型中MAPK通路的基因表达特征评分分析；（C）基于差异蛋白的通路富集分析（A-aLDL@A与对照组比较，下调蛋白前100名），重点通路用红色标出；（D）丝氨酸剥夺不同时间后CAFs中MAPK通路相关蛋白的表达；（E）丝氨酸剥夺不同时间后CAFs中MAPK通路相关基因的转录表达；（F）丝氨酸剥夺48小时后CAFs中线粒体形态变化的超高分辨率激光共聚焦显微镜评估及定量分析；（G）13C标记丝氨酸处理12至48小时后CAFs中差异蛋白的GO通路富集分析

（6）丝氨酸耗竭影响CAF中的GTP酶活性

在热应激与蛋白质折叠过程中，差异表达蛋白主要关联于HSP70，其稳定性依赖DNAJ家族蛋白调节ATP酶与GTP酶活性，同时HSP70也是GTP在细胞内运输的关键载体（图6A）。研究发现，丝氨酸耗竭可导致HSP70从细胞膜转移至细胞核周围（图6B），进而影响其向MAPK通路中GTP酶如Ras与RhoA的GTP供应（图6C）。排除PHGDH抑制剂NCT-503对MAPK通路的直接作用后（图6D），进一步证实丝氨酸耗竭顺利获得干扰核苷酸代谢与GTP稳态，引发内质网应激并改变HSP70定位。这一现象在L929成纤维细胞中同样观察到（图6E, F）。同位素标记蛋白分析显示，MAP2K7不仅参与MAPK信号转导，还在热应激响应中发挥关键作用（图6A, G），其在ICG介导的PTT治疗后于Eo771肿瘤组织中显著上调（图6H）。综上，丝氨酸耗竭顺利获得影响HSP70功能与MAPK通路活性增强PTT效果，并揭示MAP2K7为潜在增敏靶点。

图6 HSP70在丝氨酸调控MAPK通路中的作用。（A）13C标记丝氨酸处理48小时与12小时差异蛋白中具有蛋白质折叠和热反应功能的蛋白，HSP70相关蛋白用红框标出；（B）超高分辨率共聚焦显微镜评估丝氨酸剥夺对CAFs中HSP70（红色）、TOM20（蓝色）和ATP5a1（绿色）分布的影响；（C）免疫沉淀后质谱分析评估CAFs中与HSP70相互作用蛋白在对照组和丝氨酸剥夺组48小时后的表达变化，显著变化蛋白和与能量代谢最相关蛋白用红色标出；（D）不同丝氨酸来源对CAFs中MAPK通路相关蛋白的抑制作用的免疫印迹分析；（E）L929成纤维细胞系丝氨酸剥夺48小时对MAPK相关基因影响的免疫印迹和qPCR验证结果；（F）L929成纤维细胞系丝氨酸剥夺48小时对HSP70分布影响的激光共聚焦显微镜验证结果；（G）所有标记有13C丝氨酸位点的鉴定肽段中蛋白的GO通路富集分析，感兴趣通路用红框标出；（H） PTT组和对照组Eo771肿瘤中MAP2K7的表达（n = 4独立样本）

（7）MAP2K7可用作PTT致敏的新靶点

为验证MAP2K7在光热治疗（PTT）中的作用，使用MKK7抑制剂DTP3进行干预，结果显示DTP3可显著增强PTT的抗肿瘤效果（图7A, B）。进一步构建体外耐热CAFs模型（CAFs ^HR）（图7C, D），发现其在无ARS纳米平台的PTT下表现出更强的热耐受性（图7E），同时具备更强的损伤修复能力、增殖能力及炎症因子分泌水平（图7F, G）。CAFs ^HR中TNC和MYLK表达上调（图7H），提示PTT可诱导CAFs向ECM CAFs表型转化。蛋白组学分析进一步确认，MAP2K7在CAFs ^HR中高表达（图7I），并参与富含胶原的细胞外基质和整合素通路调控。基因集富集分析（GSEA）结果表明，CAFs ^HR中MAPK通路、ERK1/2级联及MAP激酶活性显著增强（图7J），ATF4与丝氨酸代谢相关信号亦同步上调（图7K）。综上，MAP2K7在促进CAFs耐热性、增强MAPK级联和丝氨酸代谢中发挥关键作用，是诱导PTT耐受的潜在调控因子。

图7 耐热CAFs的验证。（A） 结晶紫染色评估PTT单独及联合MKK7抑制剂(DTP3)对CAFs的杀伤效果；（B）CCK-8法评估PTT单独及联合MKK7抑制剂(DTP3)对CAFs的杀伤效果；（C）体外诱导CAFs ^HR示意图；（D）CAFs和CAFs ^HR的光学显微镜图；（E）PTT后96小时CAFs的结晶紫染色，激光照射区域用红色虚线标出；（F）比较 CAFs和CAFs^HR在96小时内的迁移能力；（G）CAFs和CAFs^HR在6天内的生长曲线；（H）CAFs和CAFs ^HR中TNC和MYLK表达的热图；（I）CAFs和CAFs^HR之间差异蛋白表达的火山图；（J）基于CAFs和CAFs^HR蛋白谱的GSEA分析；（K）免疫印迹法评估CAFs和CAFs ^HR中ATF4的表达