K8·凯发(中国)

针对慢性伤口治疗中电刺激疗法的局限性，四川大学高少庆/孙强团队开发了一种自供电热电水凝胶敷料。该敷料由银硒化物（Ag₂Se）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组成，能够利用伤口与环境之间的温差产生电场，从而增强内源性电场。这种增强的电场可以有效促进细胞的增殖和迁移，加速伤口的闭合，为慢性伤口的治疗给予了一种更加便捷和有效的解决方案。相关成果以《Self-Powered Thermoelectric Hydrogels Accelerate Wound Healing》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c01742）。   

Ag₂Se@GelMA水凝胶电刺激装置的制备及生物机制示意图

（1）Ag₂Se@GelMA复合水凝胶的表征

科研人员合成Ag₂Se纳米粒子（NPs），并以明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）为生物相容性支架，用于治疗剂输送。图1a的SEM图像显示Ag₂Se纳米粒子形态均匀，平均粒径150纳米；EDS分析表明Ag、Se和C元素均匀分布，证实其纯化学组成。图1b的明场TEM和HRTEM图像显示纳米粒子具有{022}和{100}晶面的晶格条纹，分别为2.6 Å和4.3 Å，确认了β-Ag₂Se晶体结构。图1c的XRD图谱表明Ag₂Se纳米粒子符合正交晶系Ag₂Se结构，晶格参数为a=4.33 Å，b=7.06 Å，c=7.76 Å。图1d的XPS谱图显示出Ag 3d和Se 3d的特征峰，证实其原始性质。顺利获得紫外线诱导光交联制备Ag₂Se@GelMA水凝胶，图1g展示了前体物质和水凝胶。冷冻干燥后的SEM表征显示，水凝胶在Ag₂Se质量分数0.0%至1.5%范围内呈现多孔结构，且EDS分析证实Ag₂Se纳米粒子在水凝胶中均匀分布。此外，该水凝胶对多种组织界面展现良好粘附性，适用于伤口敷料。图1k显示，室温下，Ag₂Se@GelMA水凝胶的塞贝克系数（S）和电导率（σ）随Ag₂Se浓度增加而增大，1.0% Ag₂Se时趋于稳定，功率因子（PF）随Ag₂Se负载量增加而增大。含有1.0% Ag₂Se的水凝胶在室温下实现约1080 μV/K的S和约0.9 mS/cm的σ，可建立伤口部位的导电微环境。

图1 Ag₂Se@GelMA水凝胶的表征和性能。（a）Ag₂Se纳米粒子（NPs）的低倍SEM图像及C、Ag、Se元素分布图；（b）Ag₂Se NPs的明场TEM和HRTEM图像；（c）XRD图谱；（d）Ag₂Se NPs的XPS全谱；（e，f）Ag₂Se NPs中Ag和Se元素的XPS谱图；（g）含Ag₂Se NPs的GelMA前体及光固化后的Ag₂Se@GelMA水凝胶数码照片；（h）不同Ag₂Se浓度（0.0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.5 wt%）的Ag₂Se@GelMA水凝胶SEM图像及EDS图；（i）Ag₂Se@GelMA水凝胶在皮肤、肝脏、肾脏、肠道和脾脏等组织上的湿附着性能；（j，k）不同浓度Ag₂Se NPs的Ag₂Se@GelMA水凝胶的塞贝克系数S、电导率σ和功率因子PF；（l，m）Ag₂Se@GelMA水凝胶对气流和物体接触刺激的电压输出，展示其环境响应性电刺激（ES）能力

（2）Ag₂Se@GelMA 水凝胶对增殖、迁移和血管生成的体外影响

科研人员顺利获得Calcein-AM/PI染色分析培养的HUVECs的生物相容性（图2a、2b）。结果显示，GelMA、Ag₂Se@GelMA和Ag₂Se@GelMA+ES处理对HUVECs均无不利影响，表明Ag₂Se@GelMA水凝胶生物相容性良好且电场强度适中。划痕愈合实验表明，Ag₂Se@GelMA+ES处理显著促进细胞迁移（图2c），36小时后细胞迁移效果显著增强。CCK-8细胞活性测定进一步证实了Ag₂Se@GelMA水凝胶的高生物相容性（图2d）。  

为评估Ag₂Se@GelMA水凝胶联合ES对血管生成的影响，检测了血管生成相关蛋白VEGF和vWF的表达水平。Western blotting（图2e、2f）和免疫荧光染色（图2g、2i）结果显示，Ag₂Se@GelMA+ES组显著上调VEGF和vWF的表达。管状结构形成实验表明，Ag₂Se@GelMA+ES组中管状长度和连接数显著高于其他组（图2h），表明Ag₂Se@GelMA水凝胶ES装置顺利获得电刺激有效增强了血管生成相关蛋白的表达并促进了血管生成。

图2 Ag₂Se@GelMA水凝胶的体外细胞毒性评估和促血管生成效应。（a）HUVECs的活细胞/死细胞荧光成像；（b）死细胞比例的量化分析；（c）HUVECs划痕伤口迁移实验图像（12、24、48小时）；（d）培养48小时后HUVECs的CCK-8细胞活性检测；（e）HUVECs中VEGF和vWF的Western blotting图像；（f）以β-actin为内参的定量分析；（g）HUVECs的免疫荧光图像，显示VEGF和vWF表达；（h）HUVECs细胞形态的光学显微镜图像；（i）6孔板中接种的HUVEC细胞VEGF和vWF表达的量化分析；（j）管状长度和每个视野连接数的量化分析

（3）Ag₂Se@GelMA 水凝胶对调节电压门控钙离子通道和线粒体结构的体外机制研究

电刺激（ES）可显著影响细胞行为，特别是内皮细胞的迁移和增殖，可能顺利获得激活CaMKKβ/AMPK/Nrf2信号通路影响血管生成。图3展示了Ag₂Se@GelMA水凝胶和ES对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）线粒体功能和血管生成的影响。图3a为机制示意图。图3b显示，Ag₂Se@GelMA+ES组细胞内Ca²⁺浓度显著高于对照组、GelMA组和Ag₂Se@GelMA组。图3c和图3d表明，该组CaMKKβ、AMPK、P-AMPK和Nrf2表达水平显著上调。图3e为不同处理后HUVECs的荧光图像，图3f对线粒体形态和网络结构进行了统计分析，发现Ag₂Se@GelMA+ES处理使线粒体形成延长、相互连接的形态。透射电子显微镜（TEM）图像（图3g）进一步证实了线粒体的延长形态。图4a和图4b显示，使用细胞膜Ca²⁺通道阻断剂GdCl₃可降低细胞内Ca²⁺浓度，而引入Ag₂Se@GelMA+ES后，细胞内Ca²⁺浓度增加。图4c表明，在GdCl₃存在时，Ag₂Se@GelMA+ES处理可显著恢复CaMKKβ、AMPK和Nrf2等关键分子的表达。图4d和图4e显示，GdCl₃阻断Ca²⁺通道导致线粒体碎片化，而Ag₂Se@GelMA+ES处理使线粒体呈现延长、杆状形态。图4f和图4g验证了Ag₂Se@GelMA+ES处理可上调VEGF和vWF等血管生成标志物的表达，且这种上调在抑制组中受到抑制。这些结果明确了电刺激引发的细胞内Ca²⁺浓度变化、CaMKKβ/AMPK/Nrf2信号通路激活与线粒体结构改变之间的联系，进一步促进了血管生成和伤口愈合。

图3 Ag₂Se@GelMA水凝胶和电刺激（ES）对线粒体功能调节的体外影响。（a）激活VGCCs和钙内流进而激活CaMKKβ/AMPK/Nrf2信号通路的机制示意图；（b）用Fluo-3 AM对HUVECs细胞内Ca²⁺水平染色的荧光图像及定量分析；（c）不同处理下HUVECs中CaMKKβ、AMPK、P-AMPK和Nrf2的Western blotting图像；（d）对应的定量分析；（e）用线粒体示踪剂Red对HUVECs染色的荧光图像；（f）线粒体形态和网络结构的统计分析，插图为（e）中放大区域，比例尺10 μm；（g）不同处理下HUVECs线粒体形态演变的TEM图像

图4 Ag₂Se@GelMA水凝胶的体外机制研究。使用细胞膜Ca²⁺通道阻断剂（GdCl₃），(a) Fluo-3 AM 染色的 HUVECs 细胞内 Ca²⁺ 水平荧光图像；(b) 定量分析；(c) HUVECs 中 CaMKKβ、AMPK、P-AMPK 和 Nrf2 的 Western blotting（WB）图像及定量分析；(d) 线粒体示踪剂 Red 染色的 HUVECs 荧光图像；(e) 平均长宽比和平均形状因子的统计分析；(f) HUVECs 中 VEGF、vWF 和 β-actin 表达水平的 WB 图像及定量分析；(g) HUVECs 中 VEGF 和 vWF 表达的荧光图像及量化分析

（4）Ag₂Se@GelMA 水凝胶敷料对伤口愈合的体内影响

在动物实验中，Ag₂Se@GelMA水凝胶敷料顺利获得蒸发冷却效应在伤口区域产生电场，显著促进伤口愈合。实验将大鼠分为PBS组、GelMA组、Ag₂Se分散液组和Ag₂Se@GelMA组，观察术后0、3、6、9、12和15天的伤口情况。结果显示，Ag₂Se@GelMA组在第3天伤口闭合率约为30%，显著高于对照组（不到20%）；第9天伤口收缩率达到84.97%，远超对照组的69.45%；第12天时，该组仅剩3.74%未愈合区域，而对照组第12天才实现超过90%的愈合效果。第15天，Ag₂Se@GelMA组伤口几乎完全闭合（图5c、图5d、图5e）。组织学分析表明，Ag₂Se@GelMA组伤口区域的再生表皮和真皮组织结构更复杂，毛囊和新生血管组织广泛分布，胶原蛋白沉积增多，肉芽组织增厚（图5f、图5g、图5h至图5k）。此外，Ag₂Se@GelMA组在第15天的VEGF和vWF表达水平显著高于其他组（图6a、图6b），表明其具有出色的促血管生成能力。该水凝胶还可显著增强Nrf2和AMPK活性（图6c、图6d），顺利获得调节线粒体功能增强能量代谢，加速伤口修复。在炎症方面，Ag₂Se@GelMA组中TGF-β和IL-10表达水平显著上调（图6e、图6f），表明炎症得到有效抑制。

图5 Ag₂Se@GelMA水凝胶敷料对伤口愈合和重塑的体内影响。 (a) 15天动物实验过程示意图；(b) 25°C下带有Ag₂Se@GelMA水凝胶敷料的小鼠示意图及热红外图像显示水凝胶温度梯度；(c) 术后0、3、6、9、12和15天不同治疗组未愈合伤口区域的代表性数码照片，观察圈模拟原始9 mm伤口；(d) 伪彩色叠加显示不同愈合阶段的伤口区域示意图；(e) 不同治疗下大鼠各时间点的伤口闭合率；(f) 第15天伤口区域的H&E染色；(g) Masson染色，红色三角形表示新生毛囊，黄色圆圈表示活跃的新生血管化，深色虚线框表示缺陷区域，左侧为缩小图像，中间为表皮放大图（Epi），右侧为真皮放大图；(h-k) 伤口长度、表皮厚度、胶原蛋白沉积和肉芽组织厚度的量化分析

图6 Ag₂Se@GelMA水凝胶敷料对伤口愈合的体内机制研究。 (a) vWF和VEGF的代表性荧光图像及(b)量化分析；(c) Nrf2、AMPK和COX IV的代表性荧光图像及(d)量化分析；(e) TGF-β和IL-10的代表性荧光图像及(f)量化分析