K8·凯发(中国)

图1 βCD-GelMA水凝胶表征。（a）GelMA、βCD-GelMA及其水凝胶的合成示意；（b）GelMA、βCD与βCD-GelMA的FTIR光谱；（c）三者的¹H NMR谱；（d）2%、5%、10% βCD-GelMA经紫外光交联后的成胶状态，标尺10 mm；（e）5%与10% GelMA或βCD-GelMA水凝胶的形变适应性，标尺10 mm；（f）5%与10% GelMA或βCD-GelMA的SEM微观形貌，标尺50 µm；（g）对应孔径统计，**p<0.01；（h）5% βCD-GelMA在37 °C下的储能模量G′与损耗模量G″随频率变化；（i）G′与G″定量值；（j）5% βCD-GelMA与8周龄小鼠新鲜脑组织的压缩应力-应变曲线；（k）两者杨氏模量对比

（2）βCD-GelMA 水凝胶形成和降解的性质

图1d–k显示βCD-GelMA水凝胶2%、5%、10% (w/v)经2 s紫外照射，仅5%与10%形成可倒置自持的固态凝胶；300 RPM振荡5 min后，5%体系保持形貌而10%体系不变，提示5%更利于填充不规则腔隙。SEM测得5% GelMA孔径331 ± 99 µm，βCD-GelMA孔径371 ± 142 µm，均大于10%体系（231 ± 35 µm 与 240 ± 48 µm）（图1f,g）。SH-SY5Y细胞3天培养未见CM-βCD、GelMA或βCD-GelMA毒性。5% βCD-GelMA在37 °C、1 Hz下储能模量G′≈0.518 kPa，损耗模量G″≈0.021 kPa（图1h,i）；压缩至30%应变时，其杨氏模量≈33 Pa，与新鲜小鼠脑组织≈30 Pa匹配（图1j,k）。FITC标记示踪显示：PBS中5%与10%水凝胶3天后荧光保留分别为79.19 ± 7.38%与81.96 ± 5.38%，5%体系在5 U mL⁻¹胶原酶中48 h后仍剩余31.82 ± 7.76%，提示5% βCD-GelMA适用于短期体内应用。 

（3）胆固醇诱导 LD 积累和随后的炎症

Raw264.7巨噬细胞经10或20 mM胆固醇处理12–24 h后，Oil Red O染色显示大量脂质滴（LDs）形成（图2a）；BODIPY定量10 mM组LDs达17.5 ± 5.3个/细胞（图2b,c）。胆固醇含量在6 h内由0.12 ± 0.02 µg/孔升至1.38 ± 0.39 µg/孔（图2d），Filipin染色证实细胞内胆固醇水平较对照升高>3.5倍（图2e,f）。βCD-GelMA水凝胶显著抑制胆固醇诱导的LD积聚（图2j），降低iNOS表达、提高CD206水平，使iNOS/CD206比值下降（图2k–m）；实时PCR亦显示iNOS、CD68、IL-6 mRNA下调，而M2标志物Arg1、CD206、Ym1上调。

图2 βCD-GelMA体外调控脂质滴（LD）及炎症表征。（a）RAW264.7细胞经1–20 mM胆固醇处理0–24 h后Oil Red O染色示LD生成；（b）10 mM胆固醇处理12 h后BODIPY荧光图，标尺10 µm；（c）LD计数定量；（d）10 mM胆固醇作用0–24 h细胞胆固醇含量；（e）6 h Filipin染色荧光图，标尺10 µm；（f）Filipin荧光强度定量；（g）10 mM胆固醇预处理6 h后细胞分别接种于平板、GelMA或βCD-GelMA水凝胶共培养6 h的BODIPY及明场图，标尺20 µm；（h）BODIPY/Hoechst荧光比值定量；（i）对应LD荧光图，箭头指示LD，标尺20 µm；（j）LD计数定量；（k）iNOS荧光强度（iNOS/Hoechst）定量；（l）CD206荧光强度（CD206/Hoechst）定量；（m）iNOS/CD206比值定量

（4）βCD-GelMA 顺利获得减轻 LD 积累来缓解细胞炎症

βCD-GelMA水凝胶显著减少10 mM胆固醇预处理的Raw264.7细胞内脂质滴（LD）数量，效果优于GelMA或空白对照（图2h），HeLa细胞亦呈一致趋势。共培养实验中，细胞跨越GelMA与βCD-GelMA界面时，LD水平随基材差异而明显不同（图2i）。βCD-GelMA进一步降低iNOS表达、提高CD206水平，使iNOS/CD206比值下降（图2k–m），并下调iNOS、CD68、IL-6 mRNA，上调M2标志物Arg1、CD206、Ym1，提示其顺利获得消耗LD抑制促炎极化。

图3 TBI小鼠胆固醇与脂质滴积聚表征。（a）Sham及TBI后D3、D7、D14、D21全脑与GFAP/IBA1免疫荧光，标尺1 mm；（b）皮层或伤区GFAP、IBA1单细胞荧光强度，n=3；（c）伤区胆固醇含量；（d）BODIPY标记LD，标尺40 µm；（e）皮层或伤区LD荧光强度；（f）Filipin胆固醇3D图与荧光图；（g）Sham、D3、D7 Filipin荧光图；（h）Filipin荧光强度定量；（i）Oil Red O染色图，标尺20 µm；（j）Oil Red O阳性面积%；（k）D7 BODIPY/IBA1共定位图；（l）D7 LD/细胞计数；（m）D7 BODIPY/iNOS/CD206共染图；（n）iNOS⁺与CD206⁺细胞LD计数

（5）TBI 小鼠模型中胆固醇和 LDs 的积累

CCI模型小鼠伤后小胶质细胞和星形胶质细胞激活（GFAP、IBA1荧光增强）于day 7 post-injury （7 dpi）达峰（图3a,b）。损伤区胆固醇含量3 dpi升至34.72 ± 7.13 mg g⁻¹，7 dpi仍保持30.29 ± 4.97 mg g⁻¹（图3c）。BODIPY标记显示LD在7 dpi积聚至峰值（图3d,e），与胶质增生同步。Filipin染色证实3 dpi及7 dpi胆固醇荧光显著高于假手术组（图3f–h）。7 dpi损伤区细胞平均>15个BODIPY阳性LD/细胞，假手术组极低；Oil Red O于3–7 dpi显著增强，7 dpi最高（图3i,j）。7 dpi样本中，BODIPY-LD与IBA1阳性小胶质细胞高度共定位，平均13.74个LD/细胞（图3k,l），星形胶质细胞未见此现象。共染iNOS/CD206显示，7 dpi时BODIPY-LD在iNOS⁺小胶质细胞中显著多于CD206⁺细胞（图3m,n），提示胆固醇及LD积聚驱动小胶质细胞向促炎M1极化。

（6）βCD-GelMA 水凝胶植入可改善 TBI 后的功能结果

图4 TBI后第3天植入βCD-GelMA水凝胶，7 dpi评估显示：FTIC标记确认腔隙填充（图4a）；βCD-GelMA组足误试验（图4b）和转棒试验（图4c）自5 dpi起优于Vehicle及GelMA组，7 dpi差异显著（#P<0.05）。7 dpi取材显示：βCD-GelMA组组织胆固醇11.12 mg g⁻¹，低于Vehicle 34.42 mg g⁻¹及GelMA 33.05 mg g⁻¹（图4e）；水凝胶自身含胆固醇9.86 mg g⁻¹，为GelMA 3倍（图4f）。组织学：βCD-GelMA组损伤周边脂质滴显著减少，Oil Red O阳性面积最低（图4i,j）；GFAP（图4k,l）与IBA1（图4m,o）荧光强度下降。IBA1阳性小胶质细胞内BODIPY-LD计数：Vehicle与GelMA组>13/细胞，βCD-GelMA组几乎为零。iNOS阳性微胶质多与LD共存，βCD-GelMA组LD缺如，CD206阳性比例升高。

图4 βCD-GelMA水凝胶植入改善TBI小鼠结局。（a）TBI后3 dpi植入50 µl水凝胶，7 dpi取材实验示意图，右侧为FβCD-GelMA/脑融合图，标尺1 mm；（b,c）Sham、TBI、GelMA、βCD-GelMA组0–7 dpi的足误试验和转棒试验，n=3，*p<0.05 vs Sham，#p<0.05 vs βCD-GelMA；（d）植入水凝胶及脑瘢痕胆固醇分布示意；（e）7 dpi瘢痕组织胆固醇含量，βCD-GelMA组11.12 mg g⁻¹，低于Vehicle 34.42 mg g⁻¹及GelMA 33.05 mg g⁻¹，***p<0.001；（f）GelMA与βCD-GelMA水凝胶内胆固醇含量，**p<0.01；（g,h）7 dpi损伤区BODIPY/IBA1共定位图及定量，标尺40 µm，**p<0.01；（i,j）7 dpi Oil Red O染色图及阳性面积%，标尺20 µm，*p<0.05；（k,l）7 dpi GFAP荧光图及定量，标尺1 mm，*p<0.05；（m,n）7 dpi IBA1伪彩图及定量，标尺1 mm，*p<0.05；（o）7 dpi IBA1免疫荧光及3D强度图，标尺1 mm