K8·凯发(中国)

针对上述问题，中南大学湘雅二医院吴军勇教授、向大雄教授联合研究团队，首次发现阿托伐他汀钙可有效诱导GBM细胞发生巨泡式死亡——一种以胞质内大空泡聚集为特征的非凋亡性细胞死亡方式。为克服AC跨血脑屏障难、脑内浓度不足的问题，团队利用AC的两亲性自组装特性，结合多巴胺聚合构建了稳定的AC纳米粒，并顺利获得超声方法包覆了PD-1过表达的BV2细胞膜，进一步修饰Angiopep-2靶向肽，最终得到AP@CM-Ang纳米药物。该纳米药物顺利获得Angiopep-2与LRP1受体结合高效跨过血脑屏障并靶向GBM细胞；PD-1细胞膜可阻断肿瘤细胞表面的PD-L1，恢复效应T细胞活性；AC则诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡，并伴随免疫刺激因子的释放，激活树突状细胞和CD8⁺T细胞，重塑免疫抑制微环境。该文章于2026年4月3日以《Atorvastatin-Driven Methuosis in Glioblastoma:A Biomimetic Nanodrug for Targeted Tumor Therapy》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c15615）。

图1. AP@CM-Ang的构建及其在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中的机制示意图。AC：阿托伐他汀钙；AP：基于AC的纳米颗粒；AP@CM：细胞膜包覆的AP纳米颗粒；AP@CM-Ang：Angiopep-2肽修饰的AP@CM。

（1）阿托伐他汀钙纳米粒的制备与表征

经PBS或AC处理的U87-MG细胞RNA-Seq分析显示，AC处理组较PBS对照组有2,378个基因上调、2,571个基因下调（图2A）。RASGRF2、RHOQP2、PIK3R3等囊泡形成相关基因显著上调，SLC家族转运蛋白和TXNIP表达升高（图2B）。KEGG通路富集分析表明AC处理激活了TNF信号通路、NF-κB信号通路及细胞因子-受体相互作用等免疫相关通路（图2C）。阿托伐他汀钙-聚多巴胺纳米颗粒（AP）的粒径为186.13±2.16 nm，zeta电位为−13.13±0.42 mV，多分散指数为0.06±0.02（图2D）。透射电镜显示纳米颗粒呈均匀球形（图2D），能谱分析证实氟元素分布均匀（图2G）。PD-1修饰的BV2细胞膜包封制备的AP@CM粒径为195.97±4.51 nm，zeta电位为−18.23±0.35 mV（图2E）。纳米流式细胞术测定包封效率为69.7%（图2H）。DSPE-PEG2000-Ang共孵育制备的AP@CM-Ang具有均匀粒径分布（图2F）、良好血清稳定性及14天储存稳定性（图2I）。AP在NaCl和SDS溶液中紫外-可见光谱出现显著位移，尿素溶液中变化可忽略（图2J-L）。AP@CM在NaCl和SDS溶液中光谱偏移较AP减弱。AC载药效率为33.03±0.23%。AP在PBS中72小时释放约68.39%的AC，AP@CM-Ang同期释放44.36%（图2O）。

共聚焦激光扫描显微镜显示，与游离DiO和负载DiO的AP相比，AP@CM和AP@CM-Ang在U87-MG和GL261细胞中表现出增强的细胞摄取（绿色荧光）（图2P、Q）。流式细胞术分析显示4°C下纳米颗粒摄取量极低，表明内化过程依赖能量；抑制剂实验表明摄取主要由脂筏、caveolin和clathrin依赖性内吞作用介导。HPLC定量结果显示，与游离AC相比，AP@CM-Ang在U87-MG细胞中的摄取量增加1.3倍，在GL261细胞中8小时后摄取量增加1.6倍（图2R）。

图2. AC负载纳米粒子的表征。（a）火山图揭示AC处理U87-MG细胞中差异表达的基因；（b）热图显示选定基因的差异表达；（c）KEGG分析显示AC处理U87-MG细胞中差异调控的免疫相关信号通路；（d–f）（d）AP、（e）AP@CM和（f）AP@CM-Ang的粒径分布和TEM图像，比例尺为100 nm；（g）AP的HAADF-STEM和EDS元素分布图，比例尺为50 nm；（h）纳米流式细胞术分析AP@CM以评估膜包覆效率，P1：细胞膜包覆的纳米粒子，P2：未包覆的纳米粒子；（i）AP@CM-Ang在14天内的稳定性；（j–l）AP在（j）NaCl、（k）SDS和（l）尿素溶液中的紫外-可见光谱；（m–n）（m）AP和（n）AP@CM在不同溶液中的粒径变化；（o）AC从AP和AP@CM-Ang中的释放曲线；（p–q）（p）U87-MG细胞和（q）GL261细胞与AP、AP@CM或AP@CM-Ang孵育后的荧光图像，蓝色：DAPI，红色：鬼笔环肽，绿色：DiO，比例尺为10μm；（r–s）（r）U87-MG细胞和（s）GL261细胞中AC的HPLC定量分析，结果以平均值±标准差（n=3）表示，P值采用单因素方差分析进行分析。

（2）体外抗肿瘤效应

CCK8法显示AC及其负载纳米颗粒对U87-MG和GL261细胞呈剂量依赖性细胞毒性，AP@CM和AP@CM-Ang增强的细胞毒性表明膜包覆和Angiopep-2修饰促进细胞摄取（图3A、I）；AP@CM-Ang处理48小时后对U87-MG和GL261细胞的IC50值分别为7.34μM和5.31μM。活/死细胞染色证实AC负载纳米颗粒增加细胞死亡（红色荧光）并降低细胞活力（绿色荧光）（图3B、J）。Annexin V-FITC/PI染色显示，U87-MG细胞中AP@CM-Ang处理组死亡率为36.24%，高于游离AC（7.06%）、AP（19.19%）和AP@CM（27.37%）（图3C、D）；GL261细胞中AP@CM-Ang处理组死亡率为39.97%，高于游离AC（20.73%）（图3K、L）。Transwell迁移实验和划痕实验表明，与游离AC相比，AC负载纳米颗粒对肿瘤细胞迁移的抑制作用更强，其中AP@CM-Ang抑制作用最显著（图3E–H）；GL261细胞中观察到类似结果（图3M–P）。

图3. 细胞毒性评估。（a）U87-MG细胞在AC、AP、AP@CM和AP@CM-Ang处理48小时后，AC浓度范围为0μM至25μM，检测细胞活力；（b）使用活/死细胞染色法检测U87-MG细胞的代表性荧光图像，比例尺为200μm；（c–d）顺利获得Annexin V-FITC/PI染色进行FCM分析，检测U87-MG细胞的死亡率；（e–f）不同处理后U87-MG细胞的迁移图像及相对定量分析，比例尺为200μm；（g–h）不同组的细胞划痕实验及相对定量分析，比例尺为100μm；（i）CCK8实验，（j）活/死细胞染色，以及（k–l）不同组GL261细胞的FCM分析，比例尺为200μm；（m–n）不同处理组的细胞迁移和（o–p）不同处理组的细胞划痕，比例尺为100μm；结果以平均值±标准差（n=3）表示，P值采用单因素方差分析进行分析。

（3）AC诱导的Methosis的特征

AC诱导GBM细胞形成大量细胞质空泡，MOMIPP作为阳性对照（图4A）；透射电镜显示GL261细胞内大量液泡聚集，线粒体、内质网等细胞器保持完整，细胞核膜完整，核染色质呈弥散状（图4B）。溶酶体示踪剂、线粒体示踪剂和内质网示踪剂标记结果显示液泡与这些细胞器无重叠（图4C、D）；Rab7免疫荧光染色显示未染色区域存在液泡，证实液泡来源于晚期内体（图4E）。Rac1表达水平在AP@CM组和AP@CM-Ang组显著上调（图4F）。

图4. 巨泡式死亡的特征分析。（a）GL261细胞经AP@CM-Ang或MOMIPP处理后的形态，箭头指示液泡的形成，比例尺为100μm；（b）经AP@CM-Ang处理的GL261细胞的透射电镜图像；（c–d）分别用Mito-Tracker、Lyso-Tracker和ER-Tracker染色的（c）U87-MG细胞和（d）GL261细胞的图像，比例尺为5μm；（e）Rab7免疫荧光染色的代表性图像，比例尺为5μm；（f）分别用（1）PBS、（2）AC、（3）AP、（4）AP@CM和（5）AP@CM-Ang处理后，对U87-MG细胞和GL261细胞中Rac1的激活进行蛋白质印迹分析和定量，结果以平均值±标准差（n=3）表示，采用单因素方差分析检验分析P值。 

（4）免疫激活潜力的研究

AC及载有AC的纳米颗粒处理的GBM细胞中CRT表达和HMGB1释放显著增加（图5A、C），ELISA法定量显示HMGB1释放水平升高（图5B、D）。骨髓来源的树突状细胞与预处理的GL261细胞共培养后，AP@CM-Ang预处理组的DC成熟率为80.0%，约为PBS组（21.1%）的3.7倍（图5E、F）。

图5. 免疫激活潜能的检测。（a）不同处理后U87-MG细胞中CRT和HMGB1的免疫荧光染色，比例尺为10μm；（b）U87-MG细胞中HMGB1的相对释放量；（c）GL261细胞中CRT和HMGB1的免疫荧光染色，比例尺为10μm；（d）GL261细胞中HMGB1的相对释放量；（e–f）不同处理组后，与GL261细胞共培养后BMDC成熟比例的检测，结果以均值±标准差（n=3）表示，P值采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。

（5）体内生物分布和肿瘤靶向

Transwell小室模型显示，与游离DiO和AP相比，AP@CM和AP@CM-Ang组的血脑屏障穿透效率显著更高，8小时后跨内皮电阻未出现显著下降（图6B）。GL261-mCherry-luc模型中，AP@CM-Ang组肿瘤部位DiR荧光强度在给药后48小时内持续增强并保持较高水平，24小时时肿瘤荧光强度约为AP@CM组的3.5倍（图6C-G）。DiO荧光与肿瘤组织共定位分析显示，AP@CM-Ang组较其他组显著增强（图6H）。

图6. 肿瘤靶向能力评估。（a）模拟体外血脑屏障的Transwell模型示意图；（b）处理8小时后下室中U87-MG细胞的代表性图像，蓝色：DAPI，绿色：DiO，比例尺为50μm；（c）GL261-mCherry-luc荷瘤小鼠在8、24和48小时不同处理后的体内荧光图像，（1）DiR，（2）AP，（3）AP@CM，（4）AP@CM-Ang；（d–g）主要器官和脑组织的体外荧光成像和定量分析；（h）不同组注射后脑组织切片的荧光扫描图，（1）DiO，（2）AP，（3）AP@CM，（4）AP@CM-Ang，蓝色：DAPI，红色：肿瘤组织，绿色：DiO，比例尺为10μm；结果以平均值±标准差（n=3）表示，采用单因素方差分析检验分析P值。

（6）治疗效果和免疫激活

GL261-luc GBM小鼠模型中，AP@CM-Ang组生物发光信号减弱，肿瘤抑制效果显著优于其他组（图7B、C）；中位生存期为31天，长于对照组（14.5天）、AC组（17天）、AP组（21天）和TMZ组（20.5天）（图7D）。磁共振成像证实AP@CM-Ang组肿瘤抑制效果最强（图7E、F）；苏木精-伊红染色显示该组颅内肿瘤面积最小（图7G）。Rab7免疫荧光染色显示AP@CM-Ang组肿瘤组织中表达增强；Ki67染色显示该组阳性细胞较PBS组显著减少（图7G）。AP@CM-Ang组体重减轻较少，主要器官苏木精-伊红染色无明显毒性，生化分析显示肝肾功能指标正常（图7H）。CD8+T淋巴细胞浸润从PBS组的29.80±5.63%增至AP@CM-Ang组的51.57±7.58%（图7I、J）；CD11b+F4/80+CD86+巨噬细胞比例从20.80±7.66%增至56.10±3.72%（图7K、L）；深颈淋巴结中CD8+T淋巴细胞比例为30.27±4.01%，树突状细胞比例为46.93±5.87%（图7M–P）。PD-1工程化细胞膜功能验证实验中，AP@CM-Ang组（G6）中位生存期为31.5天，超过抗PD-1+替莫唑胺组（G4，26天）和AP@CM-Ang无PD-1过表达组（G5，22.5天）（图8A）；苏木精-伊红染色和磁共振成像显示该组肿瘤体积最小（图8B–E）；肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润增加（图8F–I）。

图7. 治疗效果研究。（a）治疗方案示意图；（b）荷瘤小鼠第8、11、14、17和20天的肿瘤生物发光图像和（c）定量分析，G1：PBS，G2：AC，G3：AP，G4：AP@CM，G5：AP@CM-Ang，G6：TMZ；（d）生存率曲线（n=6）；（e）MRI图像和（f）不同组别的肿瘤体积；（g）肿瘤组织的H&E和Ki67染色，比例尺为50μm；（h）不同组别的体重；（i–j）肿瘤中CD3+CD8+T细胞的百分比；（k–l）肿瘤中CD86+巨噬细胞的百分比；（m–n）淋巴结中CD3+CD8+T细胞的百分比；（o–p）淋巴结中CD80+CD86+DC细胞的百分比；结果以均值±标准差（n=3）表示，P值采用单因素方差分析进行分析。

图8. PD-1工程化细胞膜功能作用验证的治疗效果研究。（a）治疗方案示意图；（b）荷瘤小鼠第8、11、14、17和20天的肿瘤生物发光图像及定量分析，实验组包括：G1（PBS）、G2（抗PD-1）、G3（AC+抗PD-1）、G4（TMZ+抗PD-1）、G5（使用未过表达PD-1的天然BV2细胞膜制备的AP@CM-Ang）和G6（AP@CM-Ang）；（c）各组的H&E染色和MRI图像；（d）肿瘤体积；（e）生存率曲线（n=6）；（f）肿瘤中CD3+CD8+T细胞的百分比；（g）肿瘤中CD86+巨噬细胞的百分比；（h）淋巴结中CD3+CD8+T细胞的百分比；（i）淋巴结中CD80+CD86+DC细胞的百分比；结果以均值±标准差（n=3）表示，P值采用单因素方差分析进行分析。