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方案1. B–Cu/HA诱导CD44靶向肿瘤治疗及免疫重编程示意图

（1）B-Cu/HA的合成与表征

B–Cu/HA顺利获得BSA模板生物矿化法合成：Cu²⁺、OH⁻和CO₃²⁻在BSA存在下共沉淀形成B–Cu，再经HA修饰取得靶向纳米平台。透射电镜（TEM）显示B–Cu/HA为粒径约6 nm的聚集纳米颗粒；动态光散射（DLS）测得平均水动力学直径约7 nm（PDI=0.189），分布较窄。元素mapping和能谱（EDS）证实C、O、N、S、Cu均匀分布。Zeta电位由B–Cu的-27.7 mV变为-31.5 mV，X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶红外光谱（FTIR）证实HA成功修饰。X射线衍射（XRD）显示无定形结构，有利于生理降解。在pH 5.5（模拟肿瘤微环境或溶酶体）条件下孵育48 h，铜离子释放约40%；而在pH 7.4（模拟正常血液循环）下仅释放约13%，表现出显著的肿瘤微环境响应性。此外，B–Cu/HA在水、PBS及DMEM+10%FBS中粒径和PDI在24 h内几乎无变化，具有良好的生理稳定性，可安全递送至肿瘤部位。

图1. B–Cu/HA的合成与表征。(A) B–Cu/HA合成过程示意图。(B, C) B–Cu/HA的明场及高角环形暗场（HAADF）透射电镜图像。比例尺 = 50 nm。(D) DLS粒径分布。(E) B–Cu/HA的元素mapping。比例尺 = 200 nm。(F) 能量色散X射线（EDX）能谱。(G) Zeta电位变化。(H) B–Cu/HA的X射线光电子能谱（XPS）全谱。(I) 傅里叶变换红外光谱（FTIR）谱图。(J) B–Cu/HA的X射线衍射（XRD）图谱。(K) B–Cu/HA在不同pH缓冲液中的铜离子释放曲线。(L) B–Cu/HA在水、PBS及DMEM+10%FBS中随时间变化的稳定性，显示水动力学粒径（实线）和PDI（虚线）。

（2）B–Cu/HA对CD44高表达肿瘤细胞的靶向摄取与增殖抑制

研究团队选取了卵巢癌（HEY、OVCAR8）、宫颈癌（HeLa、SiHa）、肝癌（SK-HEP-1、HCCLM3）和结直肠癌（SW480、HCT116）等多种肿瘤细胞系。Western blot证实HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞中CD44显著高表达；单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据也显示卵巢癌组织中CD44表达高于正常卵巢组织。CCK-8实验显示，B–Cu/HA对CD44高表达的HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞的增殖抑制效果显著优于B–Cu，IC₅₀值明显降低。IR780标记实验显示细胞对B–Cu/HA的摄取具有时间依赖性，9 h达峰。EdU掺入实验和Transwell迁移/侵袭实验表明，B–Cu/HA显著抑制DNA合成及细胞迁移侵袭能力。

图2. B–Cu/HA抑制多种肿瘤细胞系的生长。(A-D) 采用Western blot检测卵巢癌（HEY、OVCAR8）、宫颈癌（HeLa、SiHa）、肝癌（SK-HEP-1、HCCLM3）和结直肠癌（SW480、HCT116）细胞系中CD44蛋白表达。(E) 采用CCK-8法测定B–Cu和B–Cu/HA在HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞中的剂量-效应曲线。(F) 显示IR780标记的B–Cu/HA在HeLa和SK-HEP-1细胞中不同时间点细胞内摄取的荧光图像。(G) 采用CCK-8法评估HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞经纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA处理24、48或72 h后的细胞活力。(H) 采用EdU掺入实验评估HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞经纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA处理后的增殖情况。(I) 采用Transwell实验评估HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞经纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA处理后的迁移和侵袭能力。

（3）CD44介导的靶向作用验证

进一步顺利获得CD44抑制剂（Hermes-1）进行竞争性抑制实验，发现阻断CD44可显著减弱B–Cu/HA的细胞毒性和增殖抑制作用，证实其靶向效应依赖于HA-CD44相互作用。

图3. B–Cu/HA顺利获得CD44发挥靶向作用。（A）单细胞RNA测序揭示的卵巢癌组织与非恶性卵巢组织中CD44表达的UMAP图。（B）在有或无CD44抑制剂Hermes-1（10 μg/mL）的条件下，B–Cu/HA处理后HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞的细胞活力。（C）在有或无CD44抑制剂Hermes-1（10 μg/mL）的条件下，B–Cu/HA处理后HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞的增殖情况，采用EdU掺入实验进行评价。

（4）B–Cu/HA诱导铜死亡及cGAS-STING通路激活

机制研究表明，B–Cu/HA顺利获得双重机制诱导肿瘤细胞死亡。透射电镜观察到典型的铜死亡超微结构改变：线粒体肿胀、嵴丢失和膜破裂。MitoSOX染色显示线粒体ROS（mitoROS）显著累积。Western blot和qPCR证实铜死亡核心调控因子FDX1及脂酰化DLAT（Lipo-DLAT）显著上调，支持B–Cu/HA顺利获得FDX1/DLAT轴触发铜死亡。与此同时，胞内总ROS水平显著升高，激活cGAS-STING先天免疫信号通路（cGAS和p-TBK1上调），并促进细胞凋亡。顺利获得siRNA敲低cGAS进行功能拯救实验，结果显示cGAS沉默显著逆转了B–Cu/HA诱导的细胞毒性、凋亡及CD8⁺T细胞中IFN-γ⁺和GZMB⁺细胞比例的升高，证实cGAS-STING通路是介导B–Cu/HA直接抗肿瘤效应及后续T细胞免疫应答的关键枢纽。

图4. B–Cu/HA顺利获得铜死亡和cGAS-STING通路触发细胞死亡。(A) 透射电镜（TEM）图像显示B–Cu/HA处理后肿瘤细胞的线粒体超微结构改变。比例尺如图所示。(B) 四种细胞系经72 h处理后FDX1蛋白水平的Western blot分析。(C) 采用流式细胞术分析肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平。(D) 经72 h处理后cGAS、TBK1和p-TBK1水平的Western blot分析。(E) 流式细胞术测定HEY、HeLa、SK-HEP-1、SW480细胞经不同处理后的凋亡率。(F和G) 功能拯救实验显示(F) 预转染cGAS siRNA的肿瘤细胞经B–Cu/HA处理后的细胞活力（CCK-8法）和(G) 凋亡水平。(H) 流式细胞术定量分析肿瘤细胞-T细胞共培养体系中经不同处理后活性IFN-γ⁺和GZMB⁺ CD8⁺ T细胞的百分比。

（5）B–Cu/HA的转录组学分析及体外免疫增强效应

RNA测序显示，B–Cu/HA处理后HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞分别产生99、936、676和301个差异表达基因。通路富集分析发现HIF信号通路及多种细胞因子相关通路在四种肿瘤细胞中均被显著激活。GSEA进一步验证HIF-1信号通路的激活。qPCR证实EGLN1、VEGFA、HK2、SLC2A1等HIF通路标志基因及TNFSF14（LIGHT）、CSF2（GM-CSF）等细胞因子显著上调。

图5. RNA测序分析表明B–Cu/HA可调控HIF信号通路及细胞因子分泌。（A）热图显示纯水或B–Cu/HA处理后，HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞中的差异表达基因（DEGs）。（B）火山图展示纯水组与B–Cu/HA处理组之间的差异表达基因。（C）HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞差异表达基因的通路富集分析。（D，E）基因集富集分析（GSEA）显示，B–Cu/HA处理可激活HeLa和SW480细胞中的HIF-1信号通路。（F）采用qPCR验证HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞中HIF信号通路相关标志基因的表达。（G）采用qPCR分析HEY、HeLa、SK-HEP-1和SW480细胞中差异表达的细胞因子。

在肿瘤-T细胞共培养体系中，B–Cu/HA联合T细胞对肿瘤的杀伤效果最强，且显著提高了CD8⁺T细胞中IFN-γ和Granzyme B（GZMB）的表达水平，表明B–Cu/HA可顺利获得激活HIF信号和细胞因子分泌增强CD8⁺T细胞毒性功能。

图6. B–Cu/HA在体外增强抗肿瘤免疫。（A）采用外周血单个核细胞（PBMC）来源T细胞与肿瘤细胞构建共培养体系的示意图。（B）采用CCK-8实验检测对照组、单独T细胞共培养组、单独B–Cu/HA处理组以及T细胞共培养联合B–Cu/HA处理组中肿瘤细胞的活力。（C-F）采用流式细胞术分析B–Cu或B–Cu/HA处理后CD8⁺ T细胞介导的细胞毒性作用。

（6）B–Cu/HA的药代动力学、生物安全性及肿瘤靶向分布

在健康SD大鼠中，B–Cu/HA静脉给药后血铜浓度呈快速分布相和缓慢消除相，药代动力学特征良好。健康小鼠陆续在5次给药（累积铜剂量60 mg/kg）后，体重、血常规及血清生化参数均无显著异常；心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、宫颈、卵巢等主要器官H&E染色未见病理改变。延长至30天观察，依然未见慢性炎症、坏死或结构异常，证实其优异的长期生物安全性。IR780标记的B–Cu/HA在肿瘤部位1 h即可检测到荧光信号，12 h达峰并持续至24 h；ICP-MS显示肿瘤组织铜积累最高，离体荧光成像证实肿瘤高滞留和脱靶器官低分布。此外，B–Cu/HA对正常卵巢上皮细胞IOSE-80无显著毒性。

图7. B–Cu/HA的药代动力学、生物分布及生物安全性。（A）健康SD大鼠静脉注射B–Cu/HA后，血液中铜离子的循环曲线。（B）健康小鼠体内安全性评价的实验流程示意图。（C）健康小鼠静脉注射纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA后的体重变化。（D，E）健康小鼠静脉注射纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA后的血液学指标（D）和血液生化指标（E）。（F）纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA处理后，健康小鼠主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、宫颈和卵巢的苏木精–伊红（H&E）染色图像。（G）荷瘤小鼠注射IR780标记的B–Cu/HA后0、0.5、1、2、4、8、12和24 h的活体荧光图像。（H）图7G所示IR780标记B–Cu/HA在小鼠体内生物分布的荧光定量分析。（I）静脉注射B–Cu/HA后不同时间点铜元素的体内生物分布。（J）取异种移植瘤及主要器官，包括脑、心、肝、脾、肺和肾，进行离体生物分布检测。（K）图7J所示异种移植瘤及主要器官的荧光定量分析。（L）采用CCK-8实验检测纯水或B–Cu/HA处理后正常卵巢上皮细胞IOSE-80的细胞活力。（M）健康小鼠注射IR780标记的B–Cu/HA后0、0.5、1、2、4、8、12和24 h的活体荧光图像。

（7）B–Cu/HA在异种移植瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效及安全性

为评价B–Cu/HA在体内的抗肿瘤疗效，本研究建立了HEY和SW480异种移植瘤小鼠模型。荷瘤小鼠经陆续在5天给药后，B–Cu/HA组肿瘤生长受到显著抑制，肿瘤重量明显降低，且肿瘤组织中Ki67表达显著下调，表明其可有效抑制肿瘤细胞增殖；同时，主要器官形态、血液生化及血常规指标均未见明显异常，H&E染色亦未观察到明显组织毒性。上述结果表明，B–Cu/HA在异种移植瘤模型中兼具显著的抗肿瘤活性与良好的体内安全性。

图8. B–Cu/HA在HEY和SW480异种移植瘤模型中的体内抗肿瘤疗效。（A）B–Cu/HA抑制HEY和SW480异种移植瘤生长的实验设计示意图。小鼠分别经静脉注射纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA（200 μL/只，每日1次，陆续在给药5 d；每组n = 3）。（B）HEY和SW480细胞来源异种移植瘤的代表性照片。（C）HEY和SW480细胞来源异种移植瘤的肿瘤重量。（D）HEY和SW480细胞来源异种移植瘤的生长曲线。（E）小鼠异种移植瘤组织中Ki67的免疫组织化学染色。（F）纯水、HA、B–Cu或B–Cu/HA处理后小鼠的血液学及血液生化指标。（G）各处理组小鼠主要器官的代表性照片。（H）各处理组小鼠主要器官，包括心、肝、脾、肺和肾的H&E染色图像。

（8）B–Cu/HA联合免疫检查点抑制剂在肿瘤模型中的治疗效果评价

为评价B–Cu/HA与免疫检查点抑制剂（抗PD-1和抗TIGIT）联合应用的治疗效果及免疫调节作用，本研究采用卵巢癌ID8小鼠模型召开了临床前研究。实验设计如图9A所示，结果显示，B–Cu/HA联合抗TIGIT治疗可显著抑制肿瘤生长，其疗效优于各单药组及B–Cu/HA联合抗PD-1组，表现出协同抗肿瘤作用，相比之下，尽管B–Cu/HA联合抗PD-1组的肿瘤体积较对照组有所减小，但其疗效并未显著优于B–Cu/HA单药组。实验终点的肿瘤体积定量结果进一步证实，B–Cu/HA与TIGIT免疫检查点阻断具有协同抗肿瘤作用。机制上，B–Cu/HA联合抗TIGIT治疗联合策略可显著增强肿瘤内IFN-γ⁺、Granzyme B⁺ CD8⁺ T细胞及NK细胞的活化与浸润，并诱导全身性免疫调节。此外，联合治疗未引起主要器官组织损伤及血液学指标异常，具有良好的安全性。综上，B–Cu/HA可作为免疫检查点阻断治疗的有效辅助剂，顺利获得增强抗肿瘤免疫、克服肿瘤免疫逃逸并改善治疗效果，尤其与抗TIGIT联合应用时展现出显著的协同抗肿瘤潜力。

图9. B–Cu/HA与免疫检查点抑制剂（ICI）的协同作用。（A）B–Cu/HA联合ICI促进ID8荷瘤小鼠抗肿瘤免疫的实验设计。小鼠分别接受纯水、B–Cu/HA、抗PD-1、抗TIGIT、B–Cu/HA联合抗PD-1或B–Cu/HA联合抗TIGIT治疗（每组n = 3）。给药方案如下：B–Cu/HA，200 μL/只，经静脉注射，每日1次，陆续在4 d；抗PD-1，200 μg/只，经腹腔注射，每日1次，陆续在4 d；抗TIGIT，200 μg/只，经腹腔注射，每日1次，陆续在4 d。（B）各组小鼠ID8肿瘤的代表性照片。（C）各组异种移植瘤小鼠的肿瘤重量。（D）ID8荷瘤小鼠具有代表性的小动物活体成像系统（IVIS）图像。（E）各治疗组异种移植瘤的生长曲线。（F）采用流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞及脾脏免疫细胞。（G）各治疗组小鼠主要器官，包括心、肝、脾、肺和肾的代表性照片。（H，I）不同治疗后小鼠的血液学指标（H）和血液生化指标（I）。