K8·凯发(中国)

针对上述问题，宾夕法尼亚州立大学王勇教授团队从哺乳动物卵细胞的透明带中取得灵感，提出了一种仿生透明带（biomimetic zona pellucida，BZP）细胞封装策略。研究人员利用适配体介导的分子识别，将凝血酶定位在细胞表面，并进一步触发纤维蛋白原组装、海藻酸盐交联和聚赖氨酸固化，在细胞表面“原位长出”一层厚度仅约20 μm的水凝胶保护壳。整个过程无需微流控设备、无需液滴生成，并在接近生理条件的水相环境中完成，细胞封装效率达到100%。更重要的是，接受BZP包裹胰岛移植的免疫健全糖尿病小鼠能够恢复正常血糖，多数动物维持约100天，其中部分超过100天，为细胞免疫隔离给予了一条与传统“大胶囊”截然不同的技术路线。该文章于2026年8月14日以《Biomimetic zona pellucida-encapsulated islets for sustained glycaemic control in immunocompetent mice》为题发表于《Nature Biomedical Materials》（DOI：10.1038/s41551-026-01775-8）。

（1）适配体介导的仿生透明带构建与形成机制

针对三种可结合凝血酶的DNA适配体（Apt-1、Apt-2、Apt-3）进行筛选。微粒结合实验与电泳迁移率分析证实三种适配体均可结合凝血酶（图1b）；活性检测显示Apt-1显著抑制凝血酶蛋白水解活性，Apt-2、Apt-3结合后分别保留约90%和80%酶活性。适配体可将凝血酶稳定展示于模拟细胞表面的微粒上，表面滞留半衰期约3 h，固定后凝血酶维持较高催化活性（图1c,d）。在Ca²⁺存在下，表面凝血酶催化纤维蛋白原组装形成具有多孔纤维状结构的纤维蛋白（Fb）网络（图1e）；经海藻酸盐处理及Ca²⁺交联后网络孔径减小、结构致密，继续加入聚赖氨酸后微观形貌无明显变化（图1f）。数值模拟显示海藻酸盐30 min内渗透约20 μm，荧光成像证实其可进入纤维蛋白水凝胶内部。凝胶电泳证实DBCO修饰纤维蛋白原与叠氮修饰海藻酸盐发生点击化学交联，流变结果显示交联后储能模量与损耗模量均升高。条件优化显示：适配体表面吸附约10–15 min达平台，约0.5 μM趋于饱和；纤维蛋白层随纤维蛋白原浓度升高更均匀；海藻酸盐约1 h内浸润大部分纤维蛋白区域。经Ca²⁺和聚赖氨酸处理后，共聚焦显示三种组分信号明显重叠，Zeta电位随组装逐步变化，未见明显微粒聚集。上述结果验证了适配体介导凝血酶表面展示并依次完成Fb组装、海藻酸盐渗透及多重交联构建BZP的完整过程。

图1. 适配体介导的分子识别、组装与交联过程表征。（a）BZP构建示意图：适配体（Apt）介导凝血酶在细胞膜表面固定（i），凝血酶催化纤维蛋白原组装为纤维蛋白（Fb）（ii），经生物分子交联实现BZP硬化（iii）。（b）流式细胞术分析三种候选适配体与凝血酶的结合能力。（c）共聚焦观察FAM标记凝血酶在Apt功能化微粒表面的结合与分布，对照为未功能化微粒；比例尺：500 μm。（d）Apt结合凝血酶的解离与表面保留特性，表面保留半衰期（t₀.₅）约180 min；数据为平均值 ± 标准差（n = 3）。（c–d）及（e）图像均为三次独立实验的代表性结果。（e）共聚焦与SEM表征Cy5标记Fb的结构与形貌；比例尺：200 μm和50 μm（共聚焦），5 μm和1 μm（SEM）。（f）交联Fb–海藻酸盐–聚赖氨酸基质的结构表征，海藻酸盐和聚赖氨酸分别经FAM和Cy3标记，共聚焦图像为单一焦平面的代表性结果。

（2）BZP在微粒及细胞表面的均一性与普适性评价

在微粒水平评价BZP形成的均一性。在微粒表面单一焦平面上沿任意三个角度绘制穿过中心的对称直线，三条路径的荧光强度分布基本一致，表明BZP可均匀包覆微粒表面（图2a）。x–y、y–z和x–z方向投影及Z-stack三维重建显示BZP陆续在分布于微粒外围，平均荧光强度曲线表明信号主要集中于微粒表面（图2b）；相同实验在不同尺寸微粒上均观察到BZP形成，其形成不受微粒尺寸明显影响。该方法进一步应用于活细胞表面：利用胆固醇修饰的凝血酶适配体将DNA锚定至细胞膜，细胞球表面DNA展示量随DNA浓度升高逐渐增加，约0.5 μM趋于平台；初期释放后表面DNA信号保持稳定，平均表面密度约6.4 × 10⁴ molecules μm⁻²。在此基础上构建MSC或MCF7同型细胞球及由MSC、HUVEC、MDA-MB231、NIH/3T3等组成的异型细胞球，共聚焦成像显示所有细胞球表面均可形成陆续在BZP层（图2c,d），平均厚度约20 μm。除规则球形细胞团外，由两个、三个或四个细胞球融合构建的二聚体、三聚体和四聚体等不规则结构表面同样可形成BZP；在多种细胞共同组成的天然异型细胞团胰岛表面也观察到陆续在BZP包覆。上述结果表明，该方法可在不同尺寸、细胞组成及几何形态的表面上形成均一的BZP层。

图2. BZP在微粒及细胞表面的形成与均一性表征。（a）共聚焦评估BZP在微粒表面的形成均一性：沿0°、45°和90°方向绘制穿过微粒中心的三条直线，分析BZP周边的荧光强度分布；RFU，相对荧光单位；比例尺：100 μm。（b）BZP在x–y、y–z和x–z投影面的共聚焦图像，经三维Z-stack重建评估其形成的均一性与完整性；比例尺：100 μm。（c）同型MSC和MCF7细胞球表面BZP的共聚焦图像；比例尺：200 μm（上图），100 μm（下图）。（d）异型MSC和MDA-MB231/3T3细胞球表面BZP的共聚焦图像。（a–c）图像均为三次（c为3–5次）独立实验的代表性结果。

（3）BZP的分子通透性、生物相容性及细胞保护作用

评价BZP对不同分子量物质的通透能力。BZP包覆的MSC细胞球与不同分子量FITC–dextran共孵育，4 kDa dextran可自由顺利获得BZP，通透性随分子量增加逐渐降低，250 kDa时基本无法穿过（图3a）；FITC–dextran在纤维蛋白水凝胶中的扩散实验及Transwell扩散实验取得相似结果，表明BZP具有分子量依赖性的选择性通透特征。采用针对MSC表面CD73和CD90的抗体进一步验证：未包覆细胞球中抗体能正常识别并结合细胞表面，BZP包覆后抗体结合明显减少、荧光信号显著降低，表明BZP可限制大分子进入而允许小分子顺利获得。考察BZP对细胞团块的物理隔离与结构保护作用：MSC细胞球培养72 h后，未处理组大量细胞向培养板表面铺展，BZP包覆组保持原有形态，未见明显细胞黏附和铺展（图3b）；剧烈涡旋处理后，未包覆细胞球基本完全解离，BZP包覆细胞球仍维持完整球形结构（图3c），表明BZP具有机械保护和结构稳定作用。系统评价BZP形成过程对细胞活性与功能的影响：活/死染色显示BZP包覆组与未包覆组MSC细胞存活状态相似，ATP水平及代谢活性检测未见明显差异（图3d）；包覆前后MSC分泌的多种人源细胞因子水平整体差异较小，ELISA显示VEGF分泌未受明显影响（图3e）；成骨、成软骨及成脂分化实验中，BZP包覆与未包覆MSC表现出相似的分化能力。上述结果表明，BZP在实现选择性分子通透和物理保护的同时，未明显影响MSC的存活、代谢、细胞因子分泌及多向分化功能。

图3. BZP分子通透性、细胞球稳定性及生物相容性表征。（a）不同分子量葡聚糖（4、20、70、250 kDa，FITC标记）对未包覆和BZP包覆细胞球的渗透评估：室温孵育2 h后共聚焦成像；比例尺：200 μm。（b）未包覆和BZP包覆MSC细胞球在培养板表面的黏附与铺展：37 °C培养72 h后经1 μM calcein-AM（37 °C，30 min）染色并荧光成像；比例尺：200 μm。（c）涡旋处理后MSC细胞球的形态变化：未包覆和BZP包覆细胞球经60 s涡旋后荧光成像；比例尺：500 μm。（d）活/死细胞染色、ATP水平及代谢活性评价MSC细胞球活力：活/死细胞分别经calcein-AM（绿色）和EthD-1（红色）染色，共聚焦成像未包覆（左）与BZP包覆（右）细胞球；数据为平均值 ± 标准差（n = 3），P值经单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验计算；NS，无显著差异；比例尺：200 μm。（e）ELISA检测未包覆和BZP包覆MSC细胞球的VEGF分泌水平。（b–d）图像均为四次独立实验的代表性结果。

（4）BZP包裹大鼠胰岛在免疫功能健全糖尿病小鼠体内的腹腔移植评价

以胰岛移植为例考察BZP的生物医学应用潜力。嵌入厚水凝胶胶囊的胰岛虽可用于1型糖尿病免疫隔离，但其大尺寸限制移植器官容纳能力并阻碍分子转运：100万个成人胰岛（直径150 μm）累积体积约1.8 ml，经500 μm或1,500 μm胶囊封装后增至65 ml以上或近180 ml（约为裸胰岛100倍），且空微胶囊进一步增加移植体积，临床应用面临挑战。以聚苯乙烯微粒为模型的异物反应实验显示，腹腔注射后未包被微粒组第1天IL-6升高约6倍、第7天TGF-β1升高近30倍，BZP包被组升高幅度显著更小；体外免疫细胞共培养24 h后未包被球体被裂解，BZP包被球体几乎完好，表明BZP可降低异物反应并保护封装细胞免受免疫攻击。BZP包被大鼠胰岛活–死染色显示高活力（图4a）；GSIS刺激指数分别为4.6 ± 1.1和4.3 ± 0.8，Δ值（H−L1）分别为38.0 ± 11.5和27.9 ± 4.2 pmol/100 IEQ，两组无统计学差异（图4b），且包被胰岛对促炎细胞因子攻击易感性较低。将BZP包被大鼠胰岛腹腔移植至免疫功能健全糖尿病小鼠（图4c），POD 20和60行IPGTT（图4d、e）：BZP组葡萄糖清除更快，第20天血糖即恢复至健康小鼠水平，血清大鼠C肽升高（图4f）；未包被组平均血糖第9天升至316 mg dl⁻¹且从未低于200 mg dl⁻¹（图4g），BZP组第6天即降至200 mg dl⁻¹以下；未包被组60天血糖AUC为BZP组两倍以上（图4h）；BZP组至第66天仍有80%小鼠维持正常血糖（图4i），体重与存活率亦优于裸胰岛组，HbA1c较糖尿病对照降低。

图4. BZP包覆大鼠胰岛腹腔移植后在免疫功能正常糖尿病小鼠中的血糖调控效果。（a）未包覆（左）和BZP包覆（右）大鼠胰岛的共聚焦图像：活/死细胞分别经calcein-AM（绿色）和EthD-1（红色）染色，细胞核经Hoechst 33342（蓝色）染色；四次独立实验的代表性结果；比例尺：100 μm。（b）大鼠胰岛葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）检测：胰岛依次经L1（2.8 mM葡萄糖）、H（16.7 mM葡萄糖）、L2（2.8 mM葡萄糖）和KCl（2.8 mM葡萄糖 + 30 mM KCl）孵育；刺激指数为H/L1，差值（Δ）为H−L1；n = 4，P值经Welch校正的非配对双尾t检验计算。（c）STZ诱导糖尿病BALB/c小鼠接受大鼠胰岛腹腔移植的实验流程示意图，胰岛于术后第0天（POD 0）移植。（d）POD 20腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT），每组n = 5。（e）IPGTT曲线下面积（AUC）分析，每组n = 5，P值经单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验计算。（f）IPGTT期间（POD 20）葡萄糖注射前及注射后30 min的小鼠血清大鼠C-peptide水平，每组n = 5，P值经双因素方差分析（two-way ANOVA）及Tukey多重比较检验计算。（g）各组小鼠每日平均血糖水平，200–250 mg dl⁻¹以阴影区域表示；BZP包覆组1只小鼠第30天后出现持续高血糖，其后续数据未纳入曲线计算（黑色箭头）。（h）基于术后60 d血糖变化计算的AUC，P值经单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验计算。（i）胰岛移植后维持正常血糖的小鼠比例，每组n = 5。

（5）超纯两性离子改性海藻酸盐合成BZP及同种异体胰岛肾被膜下移植评价

考察封装聚合物潜在降解对胰岛保护功能的影响。荧光标记的海藻酸盐–聚赖氨酸水凝胶皮下植入后缓慢降解或溶解，主要源于人类或动物缺乏特异性降解海藻酸盐的酶；该类水凝胶作为外来材料可引发异物反应和纤维化，但上述动物研究使用的是普通海藻酸盐，既往研究表明改性超纯海藻酸盐生物相容性更高、异物反应更低。进一步采用化学改性的超纯海藻酸盐合成BZP-U：与普通海藻酸盐合成的BZP-R相比，BZP-U对BSA和溶菌酶的吸附分别降低3倍和8倍；移植后第7天TGF-β1和IL-10表达降低4倍，异物反应减轻。同种异体胰岛移植采用CD-1小鼠来源胰岛封装。移植后第40天（图5a）IPGTT显示BZP-U组较BZP-R组葡萄糖清除更快（图5b）；两组葡萄糖注射后血清C肽均升高，表明移植胰岛具有功能（图5c）。BZP-R组5只小鼠中2只第48天出现高血糖，其余分别于第57、72天开展为高血糖；BZP-U组7只小鼠仅1只第63天出现高血糖，其余6只维持正常血糖约100天（其中5只超过该时长），研究期间平均血糖始终低于250 mg dl⁻¹；BZP-U组60天AUC显著低于BZP-R组（图5d）。对照中，纳米涂层包被的同种异体胰岛移植于肾被膜下间隙，与裸胰岛类似，30天内未能使大多数糖尿病小鼠恢复血糖。与海藻酸盐微囊封装相比，BZP封装和纳米涂层因尺寸更小而扩散屏障更低；与纳米涂层相比，BZP封装和海藻酸盐微囊封装对免疫细胞攻击的保护更强。上述结果表明BZP是一种有前景的胰岛封装策略。

图5. BZP包覆同种异体胰岛移植后在免疫功能正常糖尿病小鼠中的长期血糖调控效果（BZP-R组n = 5，BZP-U组n = 7）。（a）POD 40腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）。（b）IPGTT曲线下面积（AUC）分析，P值经Welch校正的非配对双尾t检验计算。（c）IPGTT期间（POD 40）葡萄糖注射前及注射后30 min的小鼠血清C-peptide水平，P值经双因素方差分析（two-way ANOVA）及Tukey多重比较检验计算。（d）胰岛移植后维持正常血糖的小鼠比例。