K8·凯发(中国)

针对上述问题，中南大学湘雅二医院刘立宏教授团队成功开发了一种新型靶向纳米系统——巨噬细胞膜包被的柠檬酸修饰普鲁士蓝纳米酶（M@CPB）。该系统顺利获得延长纳米药物体内循环半衰期并使其在骨质疏松部位有效富集，显著增强了抗氧化活性。顺利获得调节氧化还原平衡，M@CPB能够有效逆转骨祖细胞衰老、促进骨形成，同时抑制衰老巨噬细胞中的炎症反应、减少骨吸收。总体而言，M@CPB纳米酶可从根源上阻断老年骨质疏松症（SOP）的发生与开展，为SOP的防治给予了一种安全有效的新策略。该文章于2026年7月17日以《Membrane-coated Prussian blue nanocomplex with enhanced enzyme-mimic activity alleviates senile osteoporosis by reducing osteoprogenitor cell senescence and macrophage inflammation》为题发表于《Journal of Nanobiotechnology》（DOI：10.1186/s12951-026-04771-x）。

示意图1. M@CPB的化学制备流程及其用于老年性骨质疏松的治疗策略。

（1）M@CPB的制备与表征

M@CPB由MΦm包覆CPB纳米酶构建。TEM显示CPB呈均匀立方体，M@CPB表面可见膜结构（图1A-B）。DLS测得M@CPB平均水合粒径为115.20±2.24 nm，Zeta电位为-31.50±0.46 mV，PDI为0.26±0.05（图1C），在超纯水和10% DMEM中胶体稳定性良好（图1D）。SDS-PAGE显示M@CPB保留与天然MΦm相似的蛋白谱（图1E）；Western blot证实保留CCR2、CD47、RANK和TNFR2（图1F），保留率分别为92.96±6.71%、93.35±8.67%、92.46±2.10%和92.83±1.98%。M@CPB将溶液中残余RANKL和TNF-α分别降至20.87±0.19%和24.80±0.07%（图1G-H）。酶活性方面，200 μg/mL M@CPB对O2-抑制率为42.17±0.20%，高于CPB（37.70±0.06%）和MΦm（11.49±0.16%）（图1I-L）；CAT活性显示CPB与M@CPB在120 min内持续降解H2O2，MΦm仅在前30 min快速分解（图1M-N），O2气泡实验显示120 min时CPB与M@CPB产气量显著高于MΦm（图1O），H2O2清除率为22.38±0.88%（M@CPB）、34.13±1.84%（MΦm）和9.79±3.69%（CPB）（图1P）；POD活性在650 nm处检测到吸收峰，主要源于CPB（图1Q-S），Michaelis-Menten参数Vmax=18.85 μM/min，Km=0.3008 mM（图1T）。

图1. M@CPB纳米复合物的制备与理化表征。(A,B) CPB与M@CPB的代表性TEM照片；(C) CPB、M@CPB的粒径、Zeta电位及多分散指数(PDI)；(D) M@CPB在超纯水中14天的胶体稳定性；(E) MΦm与M@CPB膜蛋白的SDS-PAGE图谱；(F) MΦm和M@CPB特征膜蛋白的Western blot检测；(G) CPB、Lip@CPB、MΦm、M@CPB孵育后上清液中剩余RANKL含量；(H) CPB、Lip@CPB、MΦm、M@CPB处理后上清液剩余TNF-α含量；(I) M@CPB类SOD纳米酶效应示意图；(J) 不同浓度CPB清除超氧阴离子(O₂-) 能力；(K) CPB、MΦm、M@CPB的O₂^-清除能力；(L) CPB、MΦm、M@CPB的O₂-清除速率；(M) M@CPB类CAT催化特性示意图；(N) 陆续在补加H₂O₂条件下CPB、MΦm、M@CPB的催化表现；(O) 纳米颗粒在0 min、120 min产生氧气气泡的代表性光学图像；(P) 10 min反应时间内CPB、MΦm、M@CPB对H₂O₂的分解效率；(Q) M@CPB类POD催化功能示意图；(R) CPB、MΦm、M@CPB组氧化TMB对应的吸光度信号；(S) 10 min内氧化TMB吸光度随时间变化曲线；(T) M@CPB针对梯度H₂O₂底物的米-曼动力学曲线；(U) M@CPB依靠多重纳米酶活性清除ROS的原理示意图。

（2）炎症靶向特性与免疫逃逸能力促进M@CPB在骨质疏松病灶处富集

M@CPB^Ce6在SOP小鼠静脉注射2 h后四肢荧光信号强于CPB^Ce6（图2A），36 h后四肢骨、腰椎及主要器官荧光保留增加（图2B, C），上肢和下肢荧光强度分别为CPB^Ce6的2.55倍和3.09倍，肝、脾、肺亦见增强（图2D），骨/肝和骨/肺靶向指数显著高于CPB^Ce6（图2E），半衰期较CPB^Ce6延长1.46倍（1.22 h vs 0.83 h；图2F, G）。体外跨内皮迁移实验显示，CCL2显著促进M@CPB^Ce6跨内皮迁移，CCR2阻断后该效应基本消除，Lip@CPBCe6转运效率与CCR2i-M@CPB^Ce6相当（图2H, I）。细胞摄取实验中，H2O2处理的MC3T3-E1细胞对纳米粒摄取增加但不受CCR2抑制或CCL2补充明显影响；RAW264.7细胞在H2O2刺激后M@CPB^Ce6摄取显著增强，CCR2阻断后显著降低，外源性CCL2促进M@CPB^Ce6摄取但对CCR2i-M@CPB^Ce6或Lip@CPB^Ce6影响甚微（图2J）。静息RAW264.7细胞对CPB^Ce6和Lip@CPB^Ce6的摄取随时间递增，而M@CPB^Ce6始终保持极低水平（图2K）。上述结果表明，M@CPB在骨质疏松部位的蓄积增强由非特异性RES摄取、延长循环的被动蓄积、CCR2介导的炎症趋向性及病灶局部细胞滞留共同贡献。

图2. 炎症归巢与免疫逃逸特性促使M@CPB在骨质疏松病灶部位富集。(A) SOP小鼠尾静脉注射CPB^Ce6、M@CPB^Ce6后2 h的活体荧光成像图；(B,C) 注射36 h后离体骨骼及主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑）的荧光检测结果；(D) 骨骼（上肢、下肢、腰椎）与主要脏器的荧光强度定量；(E) 骨-器官靶向指数统计结果；(F) 尾静脉给予CPB^Ce6或M@CPB^Ce6后24 h内不同时间点采集血浆样本的荧光图像；(G) CPB^Ce6与M@CPB^Ce6的药代动力学曲线及循环半衰期；(H) Transwell迁移实验原理示意图；(I) 纳米颗粒跨内皮迁移能力的定量评估；(J) 不同处理条件下MC3T3-E成骨前体细胞与RAW264.7巨噬细胞对M@CPB^Ce6、CCR2i-M@CPB^Ce6、Lip@CPB^Ce6的细胞摄取情况；(K) 静息状态RAW264.7巨噬细胞对CPB^Ce6、Lip@CPB^Ce6、M@CPB^Ce6的时间依赖性细胞内化。

（3）M@CPB缓解细胞水平的氧化应激损伤

在MC3T3-E1细胞中，200 μM和400 μM H2O2处理72 h后细胞存活率分别降至77.79±0.98%和69.04±1.10%，M@CPB干预后分别恢复至95.07±2.41%和93.49±2.55%（图3A, B）；活/死细胞染色显示死细胞数量显著减少（图3C, D）。胞内ROS检测显示，M@CPB显著降低H2O2诱导的ROS水平，效果优于CPB和MΦm（图3E-G）。在400 μM H2O2处理下，模型组相对ATP水平降至对照组的53.67±12.34%，M@CPB组恢复至95.19±2.44%（图3H）；JC-1染色显示M@CPB逆转线粒体膜电位下降，CPB和MΦm组效果较弱（图3I, J）；TEM显示M@CPB明显缓解H2O2诱导的线粒体嵴和基质肿胀（图3K）。

图3. M@CPB可保护成骨细胞、缓解氧化应激损伤并改善线粒体功能障碍。(A) 不同浓度H₂O₂处理后MC3T3-E1细胞的活力变化；(B) M@CPB干预下不同H₂O₂损伤模型中MC3T3-E1细胞的存活情况；(C、D) 有无M@CPB处理组MC3T3-E1细胞的Calcein-AM/PI双染共聚焦典型图像；(E、F) 采用DCFH-DA探针检测并定量统计各组MC3T3-E1细胞内ROS水平；G) DCFH-DA染色观察MC3T3-E1细胞内ROS堆积的共聚焦成像结果；(H) 不同处理条件下MC3T3-E1细胞的胞内ATP含量检测；(I、J) 顺利获得JC-1染色观测并量化分析线粒体膜电位（ΔΨm），评估线粒体功能状态；(K) MC3T3-E1细胞内部形貌特征的代表性TEM图像。

（4）M@CPB逆转成骨前体细胞衰老、促进成骨分化与骨再生

H₂O₂（400 μM）诱导的衰老MC3T3-E1模型中，β-gal阳性细胞比例升高，γ-H2AX、p16INK4a及p21表达上调（图4A-E）；M@CPB显著逆转上述改变，效果优于CPB，MΦm作用最弱，且M@CPB对p21的抑制强于经典抗氧化剂NAC，在巨噬细胞中亦呈现同等抗衰老效应。细胞周期检测显示，对照组G1/G2期分别为39.23±3.63%和19.47±0.38%，模型组为55.07±0.75%和17.10±0.53%，M@CPB组恢复至46.20±1.00%和19.47±0.38%，CPB组为49.13±0.99%和21.30±0.36%，MΦm组为51.97±0.93%和20.73±1.29%（图4F-I）。成骨分化方面，ALP活性测定显示对照组与M@CPB组分别为44.44 U/(L·gprot)和31.71 U/(L·gprot)，显著高于模型组15.14 U/(L·gprot)，CPB与MΦm仅适度提升（图4J）；ALP染色显示M@CPB组阳性染色深度及面积显著优于模型组（图4K）；ARS染色显示M@CPB组钙结节数量与面积显著大于模型组，接近对照组水平，CPB与MΦm组仅略有增加（图4L）。

图4. M@CPB可逆转成骨前体细胞衰老，有效提升细胞成骨分化能力。(A) M@CPB改善MC3T3-E1细胞衰老的作用机制示意图；(B) 不同处理条件下MC3T3-E1细胞的β-半乳糖苷酶衰老染色典型图像；(C-E) 各组细胞衰老标志物γ-H2AX、p16INK4a、p21的共聚焦免疫荧光成像结果；(F-I) 流式细胞术检测各组MC3T3-E1细胞周期分布，统计分析G1期、G2期细胞比例差异；(J) 定量检测细胞内ALP活性，评估细胞早期成骨功能水平；(K、L) 顺利获得ALP染色与茜素红S（ARS）染色直观评价不同处理组MC3T3-E1细胞的成骨分化及矿化能力。

（5）M@CPB抑制衰老巨噬细胞的炎症活化并缓解过度骨吸收

衰老RAW264.7细胞呈现M1表型，CD80上调且CD206下调；M@CPB逆转该表型并促进M1向M2极化，CPB与MΦm呈现类似但较弱趋势（图5A, B）。ELISA显示，与模型组相比，M@CPB使RANKL降低47.41%、TNF-α降低53.10%、IL-6降低45.10%，并使抗炎因子IL-10升高83.86%，CPB与MΦm组呈现类似但较弱趋势（图5C–F）。Transwell共培养实验中，骨细胞条件培养基诱导的RAW264.7破骨细胞分化显示，模型组可见大量典型多核TRAP阳性破骨细胞，CPB、MΦm及M@CPB组破骨细胞分化均受抑制，M@CPB组表型接近对照组（图5G, I, J）；巨噬细胞条件培养基作用的MC3T3-E1细胞凋亡检测显示，模型组凋亡率显著高于对照组，CPB、MΦm及M@CPB组凋亡细胞均减少，其中M@CPB组降低最显著，接近对照组水平（图5H, K, L）。

图5. M@CPB可调控衰老巨噬细胞炎症表型，抑制破骨细胞介导的过度骨吸收。(A、B) 不同处理后RAW264.7巨噬细胞M1型标志物CD80、M2型标志物CD206的免疫荧光共聚焦成像结果；(C-F) 采用ELISA法定量检测各组关键成骨、炎症细胞因子水平，包括MC3T3-E1细胞上清RANKL，以及RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-10；(G、H) 两种共培养体系原理示意图：MC3T3-E1与RAW264.7正向、反向共培养模型；(I) 经不同处理MC3T3-E1细胞上清诱导后，破骨细胞的TRAP染色典型图像；(J) 各组TRAP阳性多核破骨细胞的数量统计结果；(K) 流式细胞术检测RAW264.7细胞上清刺激后MC3T3-E1细胞的凋亡状态。(L) MC3T3-E1细胞总凋亡率（包含早期与晚期凋亡）的定量分析。

（6）M@CPB改善老年性骨质疏松引发的骨量流失、运动功能障碍及抑郁样行为

以4月龄雄性SAMP6小鼠为SOP模型、SAMR1小鼠为对照（图6A）。Micro-CT显示模型组骨量丢失明显，各治疗组有效逆转该表型，M@CPB效果最强（图6B）。骨小梁参数定量显示，对照组BV/TV、Tb.N、Tb.Th分别为28.57±5.44%、0.0037±0.0006 μm^-1、76.91±9.20 μm，模型组降至9.15±2.82%、0.0016±0.0005 μm^-1、56.08±3.95 μm，Tb.Sp和SMI由181.70±17.31 μm和1.48±0.23分别升至270.10±61.16 μm和2.38±0.15；M@CPB组恢复至35.06±4.77%、0.0040±0.0004 μm-1、87.79±9.68 μm、167.90±24.25 μm和1.31±0.19，优于CPB组（23.38±4.13%、0.0035±0.0006 μm^-1、78.31±5.67 μm、211.90±42.22 μm、1.51±0.21）和MΦm组（22.64±2.20%、0.0030±0.0006 μm^-1、77.37±9.03 μm、232.80±44.65 μm、1.78±0.17）（图6E–I）。H&E染色显示模型组股骨生长板下骨小梁显著减少，M@CPB组骨小梁结构致密，CPB和MΦm组效果较弱（图6C）；Masson染色进一步证实M@CPB骨保护作用（图6D）。

图6. M@CPB可有效挽救老年性骨质疏松模型小鼠的骨量流失。(A) 体内动物实验的整体流程与时间线示意图；(B) 各组小鼠股骨远端的微计算机断层扫描（micro-CT）三维重建典型图像；(C、D) 顺利获得H&E染色与马松三色染色对小鼠股骨切片进行组织学染色，观察骨组织形态结构变化；(E-I) 对股骨远端骨微结构核心参数进行统计学分析，包括骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）与结构模型指数（SMI），系统评价骨小梁微观结构改善情况。

（7）M@CPB顺利获得调控细胞衰老与炎症改善老年性骨质疏松的分子机制

DIA蛋白质组学分析对照、SOP及SOP+M@CPB组小鼠骨组织差异表达蛋白，PCA显示三组分离（图7A），4899个蛋白重叠（图7B）。KEGG富集显示，SOP组破骨细胞分化通路上调，细胞周期和DNA复制通路下调，SOP+M@CPB组DNA复制及神经退行性疾病相关通路上调（图7C、D）；SOP+M@CPB组细胞周期蛋白（Ccnd3、Cdk1、Cdk2、Rb1）增加、抑制因子（Rbl1、Bccip、Trp53i11）减少（图7E），成骨蛋白（P4ha1、Omd、Spp1、Plod2、Alpl、Bglap3、Col10a1）升高、破骨相关蛋白Ctsk降低（图7F）。免疫荧光显示M@CPB显著降低股骨p16INK4a、p21和γ-H2AX水平，升高NGF、NF-H/NF200及RUNX2，均强于CPB和MΦm（图7G–P）。GO分析显示M@CPB增强骨重塑调控（图8A），上调Keap1、Gpx8等抗氧化蛋白（图8B），下调NF-κB通路促炎蛋白（图8C）；免疫荧光、ELISA、免疫组化及TRAP染色分别证实M@CPB减少ROS蓄积、促进M1向M2极化、降低RANKL/TNF-α/IL-6并升高IL-10、抑制破骨细胞形成（图8D–O）。

图7. M@CPB可调控老年性骨质疏松小鼠骨组织中衰老、神经退行及成骨代谢相关关键蛋白的表达谱。(A) 主成分分析（PCA）散点图，展示对照组、模型组、M@CPB干预组骨组织蛋白质组数据的整体聚类差异；(B) 差异表达蛋白（DEPs）的韦恩分析，呈现各组差异蛋白的分布与重叠关系；(C) 差异蛋白的KEGG通路富集分析，筛选其主要富集的功能通路；(D) 基因集富集分析（GSEA）显示DNA复制相关生物学过程的显著变化；(E、F) 热图展示细胞周期调控、骨代谢稳态相关差异蛋白的表达模式；(G-K) 小鼠股骨组织免疫荧光染色，分别检测衰老标志物p16INK4a、p21、DNA损伤指标γ-H2AX、神经营养因子NGF、神经元结构蛋白NF-H/NF200以及成骨核心转录因子RUNX2的表达水平；(L-P) 定量统计各组股骨组织中p16INK4a、p21、γ-H2AX、NGF及RUNX2的平均荧光强度。

图8. M@CPB顺利获得调控骨组织炎症与骨吸收相关蛋白表达，重塑局部炎症微环境并抑制过度骨吸收。(A) 骨组织差异表达蛋白的基因本体（GO）功能富集分析；(B、C) 热图展示能量代谢与抗氧化防御、NF-κB炎症信号通路相关蛋白的差异化表达模式；(D) DHE荧光染色表征小鼠股骨组织原位ROS蓄积水平的典型图像；(E、F) 股骨组织M1型巨噬细胞标志物CD80与M2型标志物CD206的免疫荧光染色，评估局部炎症微环境极化状态；(G) ELISA法定量检测血清炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10）及破骨调控因子RANKL的含量差异；(H、I) 股骨组织免疫组化染色，观察RANKL与TNF-α在组织层面的表达分布；(J) 股骨组织TRAP染色结果，用于评价局部破骨细胞骨吸收活性；(K-O) 股骨组织中DHE、CD80、CD206、RANKL与TNF-α的染色强度定量统计分析。