K8·凯发(中国)

针对上述问题，上海交通大学詹维伟团队开发了pDA-mBP@DAT复合支架，整合生物相容性、压电响应性和可控降解性，实现对LIPUS的多模态响应。研究重点是LIPUS与支架的协同作用机制，包括LIPUS诱导的温升和微电流对成骨分化的影响，以及Piezo1离子通道顺利获得Ca²⁺/p-CaMKII通路调控成骨标志物表达的分子机制。同时开发了基于掌上超声设备的无创监测技术，实现骨再生过程的动态评估。最终目标是建立“材料 - 物理刺激 - 动态监测”一体化的骨再生治疗方案。该成果于2025年1月21日以《Low - Intensity Pulsed Ultrasound Responsive Scaffold Promotes Intramembranous and Endochondral Ossification via Ultrasonic, Thermal, and Electrical Stimulation》为题发表于《ACS NANO》。（DOI：10.1021/acsnano.4c13357)。

图1 pDA - mBP@DAT支架设计及促进LIPUS动态刺激和掌上超声诊断设备监测的膜内和软骨内骨化的研究示意图

（1）LIPUS响应支架的合成与表征

mBP纳米片的TEM图像显示其典型尺寸和0.33nm的晶格间距（图2A、B），选区衍射图证实其单晶格结构（图2C）。AFM图像显示mBP厚度约为10 - 15nm（图2D、E）。EDS光谱表明C、N、O、P元素共存（图2F）。FTIR光谱显示PDA包覆后羟基的N - H/OH伸缩振动特征谱带（图2G）。STEM - EDX和元素映射表明C、N、O、P元素在纳米片上分布良好，证实pDA修饰成功（图2H）。SEM图像显示DAT和pDA - mBP@DAT支架具有多孔结构（图2J）。酶促降解后，pDA - mBP@DAT支架的重量损失（82.5±5.4%）低于DAT支架（92.4±1.8%），表明其稳定性更好（图2K）。

图2 mBP、pDA - mBP纳米片和pDA - mBP@DAT支架的表征。（a）mBP纳米片的TEM图像和厚度；（b）mBP纳米片的选区衍射；（c）mBP纳米片的AFM图像和高度；（d）pDA - mBP纳米片的EDS光谱；（e）mBP和pDA - mBP纳米片的FTIR光谱；（f）pDA - mBP纳米片的STEM - EDX和元素映射表征；（g）不同浓度DAT和pDA - mBP@DAT支架的照片图像；（h）DAT和pDA - mBP@DAT支架的SEM图像；（i）DAT和pDA - mBP@DAT支架酶促降解后的重量损失百分比

pDA - mBP@DAT支架在LIPUS刺激下温度升高（图3A），温度随LIPUS强度和支架浓度增加而上升（图3B、C）。100μg/mL的pDA - mBP@DAT支架在0.1、0.2和0.5W的LIPUS强度下温升分别约为1.2、2.4和3.5°C（图3B）；0.1W强度下，浓度为0和50 μg/mL的支架温升较小，分别为0.3和0.5°C，而浓度为100、200和400 μg/mL时，最大温升约为1°C（图3C）。LIPUS可引起pDA - mBP@DAT支架轻微温升，有助于骨缺损修复。压电响应力显微镜（PFM）证实了pDA - mBP的压电效应，其振幅和相位模式图像显示电压随尖端位移变化（图3D、F、H、J），且在局部施加电场时呈现典型压电振幅和相位曲线（图3E、G、I、K），pDA - mBP@DAT的更高振幅蝶形环更显著地证明了其压电特性。

图3 pDA - mBP@DAT支架的压电性能及LIPUS诱导的温升。（a）不同强度LIPUS刺激下支架的温升；（b）浓度固定时不同强度LIPUS刺激下支架的温升；（c）不同浓度支架在固定LIPUS刺激下的温升；（d）pDA - mBP纳米片的PFM振幅；（e）pDA - mBP纳米片的压电响应振幅曲线；（f）pDA - mBP纳米片的相位像；（g）pDA - mBP纳米片的压电响应相位曲线；（h）pDA - mBP@DAT支架的PFM振幅；（i）pDA - mBP@DAT支架的压电响应振幅曲线；（j）pDA - mBP@DAT支架的相位图像；（k）pDA - mBP@DAT支架的压电响应相位曲线

（2）LIPUS响应支架的生物相容性、生物降解性和成骨潜力

CCK - 8试剂盒评估细胞在不同浓度支架上的增殖情况，第1天各组细胞增殖率一致，第3、5、7天0.2 μg/mL pDA - mBP@DAT支架细胞增殖率降低，0.1 μg/mL pDA - mBP@DAT支架细胞增殖率略有升高，0.2 μg/mL pDA - mBP@DAT存在细胞毒性（图4A），0.1 μg/mL pDA - mBP@DAT组细胞相容性更好。活细胞和死细胞染色显示第1、3、5天细胞数量增加，未发现明显死细胞（图4B），pDA - mBP@DATLIPUS组活细胞数量最多，无细胞毒性，LIPUS可能促进细胞增殖。LIPUS实验参数为：强度0.1W/cm²，频率1MHz，占空比50%，37℃，10min/d。Transwell板实验显示pDA - mBP@DAT组迁移细胞数量略高于对照组和DAT组，pDA - mBP@DATLIPUS组迁移数量最高（图4C、D）。扫描电镜观察到LIPUS刺激下BMSCs在支架上附着牢固且铺展良好（图4F）。茜素红染色显示pDA - mBP@DATLIPUS组矿化程度最高（图4E），矿物质沉积明显高于其他组。免疫荧光染色检测RunX2和OPN的表达，LIPUS刺激后pDA - mBP@DATLIPUS组在第14和第21天RunX2和OPN表达水平最高（图4G），其表达升高与BMSCs的迁移、黏附和成骨分化相关，LIPUS刺激下的pDA - mBP@DAT支架可促进BMSCs的这些过程。

图4 在LIPUS刺激下，pDA - mBP@DAT支架促进细胞迁移、附着和成骨分化。（a）不同浓度支架上BMSCs的CCK8定量分析；（b）共培养后活/死染色；（c）Transwell实验中迁移BMSCs的结晶紫染色图像；（d）迁移细胞数量定量分析；（e）共培养后茜素红染色及统计分析；（f）BMSCs在支架上的附着情况和形态；（g）第14天和第21天的免疫荧光染色

（3）顺利获得超声成像动态监测LIPUS响应支架的体内成骨作用

利用超声（图5）和显微CT成像（图6）评估pDA - mBP@DAT支架在LIPUS下的体内成骨效果。颅骨缺损的SD大鼠分为对照组、DAT组、pDA - mBP@DAT组和pDA - mBP@DATLIPUS组，LIPUS刺激参数为：频率1MHz，强度0.1W/cm²，占空比50%，每天20min，持续8周。掌上超声诊断设备每周动态评估骨缺损距离，持续12周（图5A）。DAT和pDA - mBP@DAT支架可完全填充大鼠颅骨缺损（图5B）。超声成像显示各组缺损区域最大距离每周缩小（图5C）。8周时，对照组颅骨缺损缩短距离较小，其他三组缺损间隙明显缩小，pDA - mBP@DATLIPUS组修复短距离骨效果最佳（图5C、D）。

图5 动态LIPUS刺激和超声成像监测pDA-mBP@DAT支架促进体内骨再生。（A）LIPUS刺激和体内动态超声成像流程示意图；（B）对照组和pDA-mBP@DAT植入组的手术图像；（C）在预定周数顺利获得掌上超声诊断设备动态评估的骨缺损距离（G1：对照组；G2：DAT组；G3：pDA-mBP@DAT组；G4：pDA-mBP@DATLIPUS组）；（D）对掌上超声诊断设备评估的骨缺损距离进行统计分析

在预定间隔取样后进行了micro-CT成像评估，其三维重建（图6A）证实pDA-mBP@DATLIPUS组成骨诱导效果最佳，且其冠状切面显示超声成像监测可替代micro-CT扫描（图6A）。四组间差异可顺利获得未修复骨区域示意图清晰显示（图6B）。定量参数分析（图6C-E）表明，pDA-mBP@DATLIPUS组骨体积（BV）最高（图6D），第12周时DAT负载组的骨体积/总体积（BV/TV）分别为35.67%±7.02%、67.67%±5.51%、83.33%±5.13%（图6E）。结果表明pDA-mBP、DAT和LIPUS协同促进骨再生，其中LIPUS是关键因素，可直接作用于细胞产生生物学效应，也能顺利获得刺激pDA-mBP@DAT支架间接产生生物学效应。

图6 显微CT成像评估pDA-mBP@DATLIPUS促进骨再生的效果。（A）显微CT图像的三维重建（上图）和冠状切面（下图）显示了预定周数的骨缺损情况；（B）四个不同组别的骨未修复区域示意图；（C-E）显微CT参数的定量分析，包括（C）骨矿物质密度（BMD）、（D）骨体积（BV）和（E）骨体积/总体积（BV/TV）

（4）Piezo1在促进LIPUS响应支架诱导的骨再生中的重要作用

H&E染色（图7A）和Masson三色染色（图7B）结果表明，pDA-mBP@DATLIPUS组胶原蛋白和新骨形成量较多，且所有支架均在8周后完全降解。定量分析H&E染色阳性面积百分比、胶原蛋白面积百分比、Masson三色染色新骨面积百分比（图7C-E）显示，pDA-mBP@DATLIPUS组骨修复促进率最高，表明在LIPUS刺激下，pDA-mBP@DAT支架能够促进骨修复。

图7 pDA-mBP@DATLIPUS加速骨再生的效果评价。（A）4、8、12周取样后骨缺损的H&E染色；（B）8、12周取样后骨缺损的Masson三色染色；（C-E）定量分析，包括（C）H&E染色阳性面积/总面积、（D）胶原面积/总面积和（E）Masson三色染色新骨面积/总面积

Col-I是骨基质主要蛋白，可激活ERK1/2信号通路等促进成骨分化。LIPUS刺激和基于BP的水凝胶能改善Col-I表达，Col-II是软骨ECM主要成分，参与调节BMSCs成骨作用。骨膜素在骨重塑和修复中起关键作用，特异性表达于骨膜且对机械应力敏感。免疫组织化学染色显示，第4和第8周，pDA-mBP@DATLIPUS组Col-I（图8A）和Col-II表达较多，表明其软骨内骨化水平高；第4周，对照组有骨膜素表达，DAT和pDA-mBP@DAT支架中表达较多但程度不一，pDA-mBP@DATLIPUS组表达最高，第8周，该组新骨边缘骨膜素表达最明显，且其膜内骨化更明显（图8B）。免疫荧光染色结果显示，第8和第12周，pDA-mBP@DATLIPUS组OCN和OPN表达最高（图8C），证实pDA-mBP@DAT在LIPUS刺激下促进骨愈合。pDA-mBP@DATLIPUS组Col-I、骨膜素、OCN、OPN和Col-II高表达（图7D-F），有力证明pDA-mBP@DAT和LIPUS在促进骨再生方面的作用，且膜内成骨和软骨内成骨均参与骨修复过程（图7G）。

图8 pDA-mBP@DATLIPUS强化膜内和软骨内成骨作用的免疫组化和免疫荧光染色评价。（A）4、8、12周取样后不同组Col-I的表达情况，粗箭头表示新生骨中Col-Ihigh的细胞，细箭头表示再生边缘中Col-Ihigh的细胞；（B）4、8周取样后不同组骨膜蛋白的表达情况；（C）8、12周不同组OCN表达情况的免疫荧光染色；（D~F）4组Col-I、骨膜蛋白和OCN相对表达量的定量分析

Piezo1能将LIPUS引起的机械信号传递至细胞内钙离子，引发MC3T3-E1细胞增殖。免疫荧光分析显示，pDA-mBP@DATLIPUS组支架与新骨边缘Piezo1表达高于其他组（图9A、E），提示Piezo1在pDA-mBP@DAT或LIPUS刺激的骨再生中发挥作用。Piezo1激活后，钙离子流入细胞质，导致下游p-CaMKII显著上调，pDA-mBP@DATLIPUS组中p-CaMKII表达增加，RunX2和CD31免疫荧光增强（图9B、C、F、G），表明p-CaMKII激活促进成骨和血管生成。CD31和α-SMA阳性染色共定位表明缺损区有成熟血管发育，且pDA-mBP@DATLIPUS组中CD31和α-SMA高表达（图9D），说明pDA-mBP@DAT支架在LIPUS刺激下促进缺损区血管生成。因此，pDA-mBP@DATLIPUS支架可能顺利获得激活Piezo1/p-CaMKII通路促进血管化骨再生，未来还需探索其他潜在分子机制。

图9 Piezo1、RunX2、p-CaMKII、CD31和α-SMA表达的免疫荧光染色。（A）第4周和第8周取样后不同组Piezo1的表达情况（N：新骨区域；M：边缘区域；S：支架区域）；（B）第8周p-CaMKII和RunX2表达的共染色；（C）第8周p-CaMKII和CD31表达的共染色；（D）第12周α-SMA和CD31表达的共染色；（E-G）定量分析，E为Piezo1表达的相对荧光强度，（F）p-CaMKII表达的相对荧光强度，（G）CD31表达的相对荧光强度