K8·凯发(中国)

研究背景：

为此研究人员该研究设计了一种名为PRIZE的P53修复纳米系统，该系统基于病毒模拟纳米结构，用于将p53 mRNA和Zn（II）递送至肿瘤细胞，顺利获得恢复细胞内P53水平来驯化肿瘤细胞，增强其免疫原性。PRIZE确保精确递送至肿瘤部位，利用其生物矿物化结构稳定p53 mRNA，并延长P53的半衰期。这项研究强调，PRIZE可以有效地修复4T1（P53缺陷型）和MC38（P53突变型）细胞中的P53异常，随后上调肿瘤细胞上主要组织相容性复合物（MHC）I类分子和表面共刺激分子CD80的表达，增强抗原呈递，并将肿瘤细胞转化为原位抗原库。共同递送的Photothermal剂（ICG）在激光照射下可以触发免疫原性细胞死亡，有效释放肿瘤相关抗原，并诱导原位癌症疫苗（ISCVs）的形成。重要的是，在P53异常肿瘤小鼠模型中，诱导的ISCVs启动癌症免疫循环（CIC），表现出卓越的肿瘤杀伤免疫力和有效阻止肿瘤转移和术后复发，这为推进个性化癌症免疫治疗给予了宝贵见解。该文章于2025年2月18日以《Restoring Tumor Cell Immunogenicity Through Ion-Assisted p53 mRNA Domestication for Enhanced In Situ Cancer Vaccination Effect》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202500825）。

研究示意图

（1）P53修复纳米系统的合成与表征

为了有效修复P53异常，研究团队设计了一种基于病毒模拟纳米结构的P53恢复纳米系统PRIZE。该系统的核心由负载p53 mRNA和ICG的ZIF-90纳米颗粒组成，称为Z@R@I，其尺寸为177.6±14.7 nm，zeta电位为-6.5±1.9 mV，具有与ZIF-90相同的菱形十二面体结构（图1a, b）。透射电子显微镜（TEM）映射分析证实了Z@R@I中N、O、Zn和P元素的存在，验证了mRNA的有效负载（图1c）。紫外-可见光谱在784 nm处的吸收峰证实了ICG的成功封装（图1d）。此外，ZIF-90顺利获得其仿生矿化功能显著延长了p53 mRNA的稳定性至7天（图1e）。在5 mM ATP作用下，Z@R@I纳米颗粒能够完全分解，mRNA释放率为96%，Zn（II）释放率为97.5%，ICG释放率为98%，证实了其良好的ATP响应性及药物释放效率（图1f）。随后，顺利获得红细胞膜（RBCM）涂覆，形成RBCM-Z@R@I，其粒径增加到203.6±15.2 nm，zeta电位显著降低到-23.4±2.3 mV（图1b）。进一步顺利获得脂质插入法将肿瘤靶向肽cRGD和溶酶体逃逸肽L17E引入，形成PRIZE，其粒径达到212.6±12.6 nm，zeta电位为-16.8±0.9 mV，且TEM显示PRIZE具有明显的膜结构（图1a）。最后，顺利获得测量在808 nm近红外激光照射下的温度变化，评估了PRIZE的光热转换能力及其诱导细胞焦亡的潜力，结果表明PRIZE具有优异的光热转换性能（图1j）。

图1 P53修复纳米系统的合成与表征。（a）Z@R@I和PRIZE的TEM图像；（b）RBCM、Z@R@I、RBCM-Z@R@I和PRIZE的尺寸和zeta电位（n=3）；（c）Z@R@I的TEM元素映射分析（Zn、O、N、P），比例尺50 nm；（d）游离ICG和Z@R@I的紫外可见吸收光谱；（e）4°C下Z@R@I中p53 mRNA的毛细管电泳稳定性分析；（f）不同ATP浓度（0、2、5 mM）下Z@R@I的体外mRNA、Zn(II)和ICG释放速率（n=3）；（g）PRIZE体内示意图；（h）尾静脉注射不同配方的Cy5标记p53 mRNA后，小鼠各器官（含肿瘤）的Cy5荧光定量（n=3）；（i）不同配方的Cy5标记p53 mRNA在小鼠体内的循环概况；（j）808 nm激光照射（2.0 W cm⁻²）下，盐水或PRIZE处理的小鼠肿瘤温度变化（n=3）；（k）PRIZE在肿瘤细胞内的示意图；（l）PRIZE处理后4T1细胞中Zn(II)含量的ICP-MS分析（n=3）；（m）PRIZE或LNP@p53 mRNA处理4T1细胞4小时后，Western印迹分析WT P53表达（n=3）

（2）PRIZE顺利获得驯化肿瘤细胞以恢复其免疫原性，将其转化为原位抗原库

WT P53顺利获得MHC I途径直接促进抗原呈递基因（B2M、Erap1、Tap1、H2-K1）和共刺激分子CD80的上调，增强肿瘤细胞的免疫原性（图2a）。实验中，顺利获得qRT-PCR和免疫荧光分析验证了PRIZE处理后4T1细胞中这些基因的显著上调（图2b），以及CD80表达的显著增加（图2d）。此外，PRIZE处理的4T1-OVA细胞成功呈递了异源MHC I结合肽SIINFEKL，而对照组未观察到此现象（图2c）。在体内实验中，PRIZE（luc）处理的4T1肿瘤荷瘤小鼠在肿瘤部位表现出更高的荧光素酶表达，证实了其高效的蛋白质表达能力（图2e-g）。进一步的免疫荧光结果显示，PRIZE处理组小鼠中P53、MHC I分子和CD80的表达显著增加，而PD-L1表达降低（图2h-k）。这些结果表明PRIZE顺利获得修复P53异常，增强了肿瘤细胞的免疫原性，将其转化为原位抗原库，为T细胞识别和清除肿瘤细胞奠定了基础。

图2 顺利获得PRIZE驯化恢复肿瘤细胞的免疫原性。（a）WT P53将肿瘤细胞驯化为高免疫原性抗原库的示意图；（b，c）qRT-PCR显示不同处理后4T1细胞中抗原呈递基因的诱导；（c）流式细胞术检测不同处理后4T1-OVA细胞表面MHC-SIINFEKL的平均荧光强度（MFI，n=3）；（d）处理后4T1细胞的免疫荧光图像及细胞表面CD80的免疫荧光染色定量分析；（e）4T1肿瘤小鼠静脉注射PRIZE（Luc）后不同时间点的体内生物发光成像及48小时后不同器官的生物发光图像；（f）4T1肿瘤中不同时间点的生物发光定量（n=3）；（g）不同器官的生物发光定量（n=3）；（h-k）4T1肿瘤接受指定治疗后，WT P53、MHC I、CD80和PD-L1表达的免疫荧光染色代表性图像及定量分析

（3）光热触发的ISCVs形成

非侵入性光疗法（包括PTT和光动力疗法）为开发稳健的原位疫苗（ISCVs）给予了机会（图3a）。实验中，顺利获得与PRIZE共递送ICG到肿瘤细胞，经过NIR照射（43°C，5分钟）后细胞存活率仅为13.6%，显示出优异的免疫原性细胞死亡（ICD）疗效（图3b）。ICD与损伤相关分子模式（DAMPs）的释放相关，可刺激抗肿瘤免疫反应并触发ISCVs形成。体外实验表明，PRIZE+NIR显著诱导4T1细胞发生ICD并释放DAMPs，如CRT暴露、HMGB1和ATP释放（图3c, d）。此外，将BMDCs与PRIZE+NIR预处理的4T1细胞共培养可显著提高DCs的成熟度（图3e, f）。

细胞毒性CD8+ T细胞是适应性免疫系统的核心效应细胞。实验中，将CD8+ T细胞与由PRIZE+NIR处理的4T1细胞成熟的BMDCs共培养，显著增加了CD8+GZMB+细胞的百分比（43.3%），并显著提高了TNF-α和IL-12p70的水平，表明CD8+ T细胞功能的激活（图3g, h, i）。形态学检查显示，PRIZE+NIR组中许多细胞出现细胞焦亡形态（图3j），表明PTT成功触发了PRIZE预处理肿瘤细胞中抗原的释放，形成ISCVs，并诱导抗肿瘤免疫反应。

PTT可能顺利获得增加血氧水平和破坏物理屏障来增强免疫细胞浸润。激光血流成像显示NIR照射增加了小鼠的血流速度，光声成像表明4T1肿瘤组织中的血氧含量升高（图3k, l）。此外，H&E染色证实NIR治疗后肿瘤组织内松散区域的扩张（图3m），表明PTT对物理屏障的破坏作用。这些发现为顺利获得PRIZE+NIR在体内有效激活免疫反应和实现强大的抗肿瘤效果奠定了基础。

图3 PRIZE+NIR引发ISCV的形成。（a）NIR加速ISCV形成示意图；（b）PZE、PRZE、PRIZE和PRIZE+NIR（43°C，5分钟）处理4T1细胞24小时后的细胞相对活力；（c）不同处理后4T1细胞中CRT和HMGB1的免疫荧光图像；（d）不同处理后4T1细胞的细胞外ATP浓度（n=3）；（e）BMDC成熟和CD8+ T细胞活化示意图；（f）4T1细胞与BMDC共培养24小时后成熟BMDC的流式细胞术定量（n=3）；（g）与上述BMDC共培养后活化CD8+ T细胞的流式细胞术定量（n=3）；（h，i）T细胞与成熟BMDC（CD80+ CD86+）共培养24小时后，顺利获得ELISA检测TNF-α（h）和IL-12p70（i）的产生（n=3）；（j）Cell Tracker™ DiI标记的活化CD8+ T细胞攻击4T1细胞的代表性图像（n=3）；（k）NIR照射前后小鼠肿瘤部位的血液灌注图像及定量（n=3）；（l）NIR前后4T1肿瘤的PA成像及平均sO₂的量化（n=3）；（m）NIR前后4T1肿瘤的H&E染色

（4）ISCVs在双侧4T1肿瘤模型中的治疗功效

顺利获得双侧BALB/C肿瘤模型评估了ISCVs的抗肿瘤效果。当原发肿瘤体积达到100 mm³时，小鼠分为四组（每组8只），分别接受生理盐水、PIZE+NIR、PRIZE或PRIZE+NIR处理，每三天静脉注射一次，共五次。对于PIZE+NIR或PRIZE+NIR组，在注射后24小时对右侧（原发）肿瘤进行额外的激光照射（43°C，5分钟）（图4a）。结果显示，PRIZE治疗或PIZE+NIR治疗单独抑制了4T1肿瘤的双侧生长，但PRIZE+NIR治疗效果更优，从个体生长曲线和平均肿瘤体积中可以看出（图4b）。接受联合治疗的小鼠中约75%存活，而其他组小鼠在60天内死亡（图4c）。这些结果强调了修复P53异常以增强肿瘤细胞免疫原性的重要性。

PRIZE+NIR显著促进了DC成熟，增加了原发和远处肿瘤中CD3+CD8+ T细胞和CD8+GZMB+ T细胞的浸润（图4d, e）。此外，PRIZE+NIR处理组在远端肿瘤、淋巴结、脾脏和周围血液中产生更高比例的CD3+CD8+ T细胞（图4f）。RNA测序显示，PRIZE+NIR治疗的肿瘤组织中p53和免疫激活相关基因表达上调，免疫细胞类型发生改变，包括T细胞、NK细胞和活化DCs（图4g）。与TAMs（M1和M2）、MDSCs和Tregs相关的基因表达发生变化，重塑了免疫抑制的TME。流式细胞术分析显示，PRIZE+NIR组中MDSCs和Tregs比例显著降低，M1/M2比率增加（图S24b）。体内结果表明，PRIZE+NIR顺利获得激发适应性免疫反应和调节TME，显著增强了ISCVs的疗效（图4h）。

图4 ISCVs在双侧4T1肿瘤模型中的治疗效果。（a）双侧BALB/c肿瘤实验设计示意图；（b）原发性肿瘤和远处肿瘤的个体肿瘤生长动力学（每3天记录一次）；（c）各组生存曲线（n=8）；（d）不同组小鼠原发性肿瘤和远处肿瘤中CD3+ CD8+ T细胞浸润百分比（n=3）；（e）原发性肿瘤和远处肿瘤中CD8+ GZMB+ T细胞的免疫荧光分析；（f）不同组小鼠淋巴结、血液和脾脏中CD3+ CD8+ T细胞浸润百分比（n=3）；（g）小鼠原发性肿瘤组织经生理盐水、PRIZE+NIR处理后，免疫细胞类型相关基因的转录组分析差异基因聚类热图（n=3）；（h）PTT与PRIZE驯化协同激活CIC并增强ISCV疗效的示意图

（5）顺利获得PRIZE+NIR抑制肿瘤转移和复发

为了评估PRIZE+NIR在治疗肿瘤转移和复发方面的潜力，研究者建立了相关模型并进行了实验。在4T1肿瘤携带小鼠中，PRIZE+NIR显著减少了肺部转移肿瘤负荷，肺重量接近正常水平（图5a, b），且H&E染色显示PRIZE+NIR组肺部转移性结节数量减少了约60%（图5c, d）。此外，PRIZE+NIR处理的血清中IFN-γ和TNF-α水平最高（图5e, f），表明其优化的抗肿瘤免疫反应。顺利获得IVIS Lumina II成像系统监测肿瘤转移，发现PRIZE+NIR显著增加了外周血和脾脏中效应记忆T细胞（T EM）和中央记忆T细胞（T CM）的比例（图5g-j），小鼠存活率显著提高至70%（图5k），突出了其在抑制肿瘤转移和延长生存时间方面的潜力。

进一步的肿瘤复挑战模型实验表明，PRIZE+NIR治疗的小鼠在复挑战后4T1肿瘤完全消退（图5l, m），且外周血和脾脏中记忆T细胞数量显著增加（图5n, o），显示出强大的长期免疫记忆效应，有效防止肿瘤复发。这些结果表明PRIZE+NIR在激活持久免疫记忆效应方面的重要性。

图5 预防肿瘤转移和复发的长期记忆效应。（a）4T1 转移模型中 PRIZE+NIR 触发癌症免疫疗法的示意图；（b）研究结束时小鼠肺重量（n=5）；（c）肺组织 H&E 染色图像；（d）肺转移节点量化（n=5）；（e, f）ELISA 测定血清中 IFN-γ 和 TNF-α 水平（n=5）；（g, h）4T1 转移模型小鼠血液和脾脏中 T EM 和 T CM 的流式细胞术分析（n=3）；（i, j）T EM 和 T CM 的百分比（n=3）；（k）4T1 肺转移小鼠总生存率（n=8）；（l）PRIZE+NIR 介导的 4T1 肿瘤模型预防复发方案；（m）肿瘤生长曲线；（n, o）不同治疗后小鼠血液和脾脏中 T EM 和 T CM 的百分比（n=3）

（6）PRIZE+NIR对P53突变MC38结直肠癌肿瘤模型的抗肿瘤疗效

在P53突变的MC38肿瘤C57BL/6小鼠模型中，PRIZE+NIR治疗显著抑制了肿瘤生长并实现了肿瘤完全清除（图6a, b）。免疫荧光验证了NIR诱导的I型细胞死亡（ICD），表现为显著的CRT外化和HMGB1转位（图6c）。治疗后，免疫荧光图像显示CD8+ T细胞的激活增强（图6d），流式细胞术分析表明肿瘤组织中T细胞浸润水平显著增加（图6e, f），且CD8+GZMB+和CD8+IFN-γ+ T细胞群体显著增加（图6g, h），表明PRIZE+NIR增强了CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。生存曲线分析显示，PRIZE+NIR治疗将MC38结直肠癌小鼠的存活率提高到60%（图6i），突显了其强大的抗肿瘤疗效。这些结果表明P53修复策略在p53突变肿瘤模型中具有显著的治疗潜力。

图6 PRIZE+NIR 对 p53 突变肿瘤的抑制作用。（a）MC38 肿瘤模型中 PRIZE+NIR 引发的癌症免疫疗法示意图；（b）肿瘤生长曲线（n=8）；（c）代表性免疫荧光图像，显示不同处理后肿瘤中 CRT 和 HMGB1 的表达；（d）不同处理后肿瘤中 CD8⁺GZMB⁺ T 细胞和 CD4⁺Foxp3⁺ T 细胞的免疫荧光分析；（e, f）流式细胞术检测不同处理后肿瘤中浸润的 CD3⁺CD8⁺ T 细胞和 CD3⁺CD4⁺ T 细胞（n=3），并进行定量分析；（g, h）流式细胞术检测并量化不同处理后肿瘤中 CD8⁺GZMB⁺ T 细胞和 CD8⁺IFN-γ⁺ T 细胞的表达水平（n=3，代表性门控策略见图S30）；（i）不同处理后 MC38 肿瘤 C57BL/6 小鼠的总生存率（n=8）