K8·凯发(中国)

针对上述问题，山东第一医科大学董自亮研究员团队团队设计了一种pH响应型锰/铝层状双氢氧化物纳米片（LDH NSs），负载CD73抑制剂PSB-12379（记为LDH@PSB），用于同步中和肿瘤酸中毒和阻断ADO介导的免疫抑制，以增强放射免疫治疗。该纳米片在弱酸性肿瘤微环境（pH ~6.5）下快速降解，提升细胞外pH并释放PSB-12379，抑制放疗诱导的CD73上调和ADO产生；同时释放的Mn²⁺离子激活cGAS-STING通路，协同放疗诱导的免疫原性细胞死亡（ICD），放大抗肿瘤免疫。在小鼠B16F10黑色素瘤和CT26结肠癌模型中，LDH@PSB联合放疗显著抑制肿瘤生长、延长生存期，并增加具有增强细胞毒性的肿瘤浸润CD8⁺ T细胞。联合anti-PD-1治疗进一步诱导全身免疫，根除远处肿瘤。该策略同时缓解肿瘤酸中毒、破坏ADO介导的免疫抑制并激活cGAS-STING信号，为增强放射免疫治疗给予了一种强效方法。该文章于 2026 年 1 月 31 日以《Dual metabolic restructuring against tumor acidosis and adenosine potentiates radioimmunotherapy via reinvigoration of CD8+ T lymphocytes》为题发表于《Nano Today》（DOI：10.1016/j.nantod.2026.102997）。

方案1. LDH@PSB纳米片的设计与机制示意图

（1）LDH@PSB纳米片的制备与表征

顺利获得共沉淀法（Mn/Al = 3/1）合成Mn/Al LDH纳米片，经静电相互作用负载PSB-12379。TEM显示LDH NSs呈六边形形貌，平均粒径约90.5 nm，AFM显示平均厚度约5.0 nm；HAADF-STEM元素mapping证实Mn、Al、O均匀分布。ICP-MS测得Mn和Al含量分别为31.8%和6.08%。PVP修饰后DLS尺寸从69.5 nm降至58.6 nm，分散稳定性改善；Zeta电位从+30.9 mV变为+4.4 mV，HPLC测定药物负载效率达84.8%。FTIR在580 cm⁻¹（Mn-O）和429 cm⁻¹（Al-O）处识别特征金属-氧振动，1650 cm⁻¹和1294 cm⁻¹处新吸收带对应PVP的-C=O和-C-N基团。XRD显示（003）、（006）、（009）、（018）和（110）晶面典型衍射峰，与标准PDF卡片（JCPDS No. 45-1475）一致。XPS证实Mn 2p₃/₂（642 eV）和Mn 2p₁/₂（653 eV）双峰，表明主要Mn²⁺氧化态。LDH@PSB NSs具有pH响应性：TEM显示pH 5.5时纳米片溶解而pH 7.4时结构完整，DLS尺寸从pH 7.4到5.5减少59.4%；pH 5.5条件下4小时内释放63.3% Mn²⁺和85.4% PSB，pH 6.5时释放15.6% Mn²⁺和37.6% PSB，pH 7.4时释放最小。BCECF比率成像验证该趋势，pH电极显示LDH@PSB浓度从0增至540 μg/mL时，pH从6.5升至7.4，证实其酸中和能力。

图1. LDH@PSB NSs的制备与表征。（A）LDH@PSB NSs合成过程示意图。（B）LDH NSs的典型TEM图像。（C）LDH NSs的元素mapping图像。（D）LDH NSs的AFM图像。（E）裸LDH、PVP修饰LDH和LDH@PSB NSs的尺寸分布。（F）LDH、PVP-LDH和LDH@PSB NSs的Zeta电位测量。（G）LDH和PVP-LDH NSs的FTIR光谱。（H）LDH NSs的XRD图谱。（I）LDH NSs的全范围XPS光谱。（J）Mn 2p的高分辨XPS光谱，显示LDH NSs中的氧化态。（K）LDH@PSB NSs的pH响应降解行为和后续药物释放示意图。（L）不同pH条件下孵育后LDH@PSB NSs形貌的TEM图像。（M-N）不同pH值下Mn²⁺（M）和PSB-12379（N）从LDH@PSB NSs的累积释放曲线。（O-P）BCECF的多光谱荧光成像（O）和相应荧光强度定量分析（P）。（Q）LDH@PSB NSs在弱酸性缓冲液（pH 5.5和6.5）中的酸中和曲线。

（2）LDH@PSB NSs的体外放射增敏效应

酸性肿瘤微环境顺利获得增强DNA修复能力和延迟辐射诱导的G2/M期阻滞退出来促进放疗抵抗。LDH@PSB纳米颗粒在L929和NIH 3T3正常细胞中表现出可忽略不计的细胞毒性，具有良好的生物安全性。定量pH电极测量和BCECF荧光检测证实其可将培养基pH从6.5有效中和；细胞内红色荧光强度随时间递增，证实顺利获得内吞途径有效摄取，且CT26肿瘤细胞较3T3正常细胞显示出更强的荧光信号，表明癌细胞优先摄取。共聚焦成像与BCECF探针显示细胞内pH显著升高。γ-H2AX免疫荧光染色显示，pH 6.5条件下经LDH@PSB + X射线处理的CT26细胞DNA双链断裂显著增强，损伤水平与pH 7.4 + X射线组相当，且对CT26癌细胞的选择性增强优于3T3正常细胞。克隆形成实验验证了剂量依赖性放射增敏效应，流式细胞术和共聚焦荧光图像显示LDH@PSB + RT组ROS生成延长，凋亡率显著升高至约30.8%，活/死染色和MTT测定证实其显著诱导肿瘤细胞死亡。

图2. LDH@PSB NSs放射增敏效应的体外评价。（A）LDH@PSB酸度中和行为和增强放射敏感性示意图。（B）与不同浓度LDH@PSB孵育的L929细胞的相对细胞活力（n = 6）。（C）0、1、2和4小时DiD标记LDH@PSB NSs的时间依赖性细胞摄取，顺利获得共聚焦荧光显微镜可视化。（D-E）CT26细胞经各种处理后γ-H2AX的免疫荧光染色（D）和定量平均荧光强度（E）。（F）CT26细胞经LDH@PSB NSs联合不同X射线照射（0、2、4、6和8 Gy）处理的克隆形成实验代表性图像。（G）CT26细胞经各种处理后细胞内ROS生成的共聚焦荧光成像。（H-I）各种处理后Annexin V/PI染色细胞凋亡的流式细胞术图（H）和相应定量分析（I）。（J）CT26细胞在不同pH条件（pH 7.4和6.5）下与LDH@PSB纳米片孵育后暴露于不同剂量X射线照射（0-8 Gy）的相对细胞活力。

（3）LDH@PSB NSs体外调控CD73表达和cGAS-STING激活

肿瘤细胞过表达代谢免疫检查点分子CD73，催化细胞外ATP转化为免疫抑制性腺苷（ADO），抑制抗肿瘤免疫反应，且放疗进一步上调CD73表达。Western blot分析显示，X射线照射和LDH均显著上调CT26、4T1、B16F10肿瘤细胞CD73蛋白，而预孵育LDH@PSB后接受X射线照射的细胞CD73表达显著受抑，证实PSB-12379可减弱放疗诱导的CD73上调；正常3T3细胞中未观察到辐射诱导的CD73上调，表明该反应具有肿瘤特异性。照射后2小时，LDH+RT和LDH@PSB+RT组ATP释放均显著增加；24小时时LDH+RT组ATP水平显著下降，而LDH@PSB+RT组维持高水平细胞外ATP，且ADO产生显著降低，证实PSB-12379阻断ATP酶促水解。Western blot显示LDH@PSB+RT组磷酸化STING（p-STING）、TBK1和IRF3蛋白表达显著增加，与游离Mn²⁺和商用STING激动剂MSA-2阳性对照模式一致；qPCR分析显示该组CXCL-10、IFN-β和IL-1β转录水平最高，甚至超过阳性对照。共聚焦荧光成像显示LDH@PSB+RT组细胞表面CRT暴露最强，细胞内HMGB1荧光几乎消失，证实其有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。

图3. LDH@PSB介导的辐射诱导CD73上调抑制和cGAS-STING通路激活。（A）X射线辐射后各种肿瘤细胞中CD73上调及其被LDH@PSB NSs抑制的示意图。（B-C）不同处理下CT26、B16F10和4T1细胞中CD73表达的流式细胞术分析（B）和相应定量比较（C）。（D）不同处理后肿瘤细胞在2h和24h分泌的外源性ATP水平。（E）不同处理后肿瘤细胞在24h分泌的外源性ADO水平。（F）LDH@PSB介导的ATP水解为免疫抑制性代谢物ADO的抑制示意图。（G）不同处理后STING通路激活的Western blot分析。（H-J）不同处理后CXCL10（H）、IFN-β（I）和IL-1β（J）mRNA表达水平的qPCR分析。（K）不同处理后CRT暴露和HMGB1释放的免疫荧光图像。（L）LDH@PSB释放Mn²⁺触发cGAS-STING通路激活的示意图。

（4）LDH@PSB联合RT体外免疫激活评价

免疫刺激信号可促进树突状细胞（DC）成熟。将小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）与经不同处理的CT26细胞上清液共孵育后，LDH@PSB+RT组DC成熟率达42.6%，为对照组的2.89倍，且显著诱导TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12p70等炎症细胞因子分泌。使用CFSE标记T细胞评估增殖，流式细胞术显示LDH@PSB+RT组增殖率约73.8%，显著优于LDH+RT组，归因于酸度中和与CD73抑制的协同效应。该组共培养上清液中ATP水平显著升高而ADO水平降低，证实有效抑制ADO生成并保留免疫刺激性ATP。进一步分析显示，LDH@PSB+RT组CD69⁺ T细胞比例最高，Granzyme B（GzmB）和IFN-γ表达显著升高，同时PD-1和TIGIT等耗竭标志物表达显著降低，提示有效逆转T细胞功能障碍；该组IFN-γ和IL-12p70水平亦最高，反映T细胞激活与免疫刺激增强。

图4. LDH@PSB联合放疗诱导ICD和T细胞激活的体外评价。（A）LDH@PSB介导的放疗增敏ICD效应导致DC成熟的示意图。（B-C）DC成熟的流式细胞术分析（B）和DC成熟百分比定量（C）。（D）LDH@PSB和RT触发增强T细胞功能和炎症细胞因子分泌的示意图。（E-F）CFSE标记CD8⁺ T细胞增殖的流式细胞术图（E）和定量（F）。（G-J）关键CD8⁺ T细胞细胞毒性效应分子IFN-γ（G,H）和Granzyme B（I,J）的流式细胞术分析和定量。（K-L）不同处理后CD8⁺ T细胞上耗竭标志物PD-1表达的流式细胞术分析（K）和定量（L）。（M-N）炎症细胞因子分泌水平的ELISA分析，包括IFN-γ（M）和IL-12p70（N）。（O）LDH@PSB介导的肿瘤酸中毒和ADO双重代谢调节使T细胞从耗竭转变为激活的表型变化示意图。

（5）LDH@PSB联合RT的体内抗肿瘤效应评价

DiD标记的LDH@PSB在CT26肿瘤模型中主要特异性蓄积于肿瘤内，24小时达峰值，72小时逐渐降低，ICP-MS定量锰离子分布趋势一致，证实其肿瘤靶向蓄积与代谢清除；BCECF探针瘤内pH mapping证实有效中和酸性肿瘤微环境。CT26荷瘤小鼠分组治疗后，LDH@PSB+RT组γ-H2AX免疫荧光呈强红色荧光，CD73表达受抑，肿瘤完全根除并实现长期无瘤生存，无显著体重波动；CRT和HMGB1染色证实有效诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。对治愈小鼠以4T1细胞再次攻击，肿瘤生长与对照组无差异，表明免疫记忆具有CT26抗原特异性。B16F10黑色素瘤模型中，LDH@PSB+RT组肿瘤生长抑制最显著，生存期延长，H&E和TUNEL证实肿瘤组织损伤与凋亡最强；流式细胞术显示该组肿瘤内CD8⁺CD3⁺ T细胞比例增加，CD69表达升高，IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞比例达72.6%（对照组24.8%的2.92倍），血清及肿瘤上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β和IL-12p70水平显著升高，证实其有效增强免疫细胞浸润、细胞毒性T淋巴细胞激活及促炎细胞因子释放，诱导强劲抗肿瘤免疫反应。

图5. LDH@PSB联合RT对CT26荷瘤小鼠模型抗肿瘤效应的体内评价。（A）CT26荷瘤小鼠模型中治疗方案和时间线示意图。（B-C）各种处理后肿瘤组织中γ-H2AX的免疫荧光染色图像（B）和相应定量荧光分析（C）。（D-E）各种处理后肿瘤中CD73表达的免疫荧光图像（D）和相应定量荧光分析（E）。（F）不同处理后的平均肿瘤生长曲线。（G）不同治疗组小鼠的生存曲线。（H）所有治疗组每只小鼠的个体肿瘤生长曲线。（I）CT26荷瘤小鼠整个监测期间的体重变化。（J-K）各种处理后肿瘤组织中CRT（J）和HMGB1（K）的免疫荧光染色图像。（L）各种处理后肿瘤组织中CRT和HMGB1表达的定量荧光强度分析。

图6. LDH@PSB联合RT对B16F10荷瘤小鼠模型抗肿瘤疗效和免疫反应的体内评价。（A）B16F10荷瘤小鼠模型中治疗方案和时间线示意图。（B-C）不同治疗组的平均（B）和个体（C）肿瘤生长曲线。（D）不同治疗组小鼠的生存曲线。（E）治疗期间CT26荷瘤小鼠的体重变化。（F-G）各种处理后肿瘤组织中CD8⁺ T细胞群体的流式细胞术图（F）和相应定量（G）。（H-I）各种处理后CD8⁺ T细胞中IFN-γ⁺的流式细胞术图（H）和相应定量（I）。（J）不同处理后肿瘤组织中活化CD8⁺ T细胞（CD69⁺）的比例。（K）不同处理后肿瘤组织中NK细胞（NK1.1⁺CD3⁻CD45⁺）的百分比。（L-M）不同处理后肿瘤组织中抗肿瘤细胞因子分泌水平的ELISA检测，包括IL-1β（L）和IL-12p70（M）。（N-Q）不同处理后肿瘤组织中CD45⁺（N,O）、CD3⁺（N,P）和CD8⁺（N,Q）免疫细胞的免疫荧光染色图像和相应定量分析。

（6）LDH@PSB + RT联合免疫检查点阻断的远隔效应

为进一步研究LDH基础治疗联合免疫检查点阻断的潜力，研究团队建立了双侧B16F10黑色素瘤模型，以评估对原发和远处肿瘤的抑制。治疗包括aPD-1、LDH@PSB + RT和LDH@PSB + RT + aPD-1。观察到LDH@PSB + aPD-1检查点阻断治疗的联合对原发和远处肿瘤生长均表现出实质性抑制，所有五只小鼠存活。在整个治疗期间，未观察到显著的体重变化，表明优异的生物安全性。免疫荧光染色进一步显示，联合组两个肿瘤部位中CD3⁺和CD8⁺ T细胞浸润显著增加，提示强劲的全身免疫激活。这些结果表明，LDH@PSB + RT与aPD-1检查点阻断的联合不仅增强了局部肿瘤控制，还引发了强效的远隔效应，有效抑制了远处肿瘤生长。

图7. LDH@PSB + RT联合免疫检查点阻断的远隔效应。（A）双侧B16F10肿瘤模型的建立和相应治疗方案示意图。（B）不同处理后小鼠原发和远处肿瘤的生长曲线。（C）各种处理后小鼠的存活率。（D）B16F10荷瘤小鼠治疗期间的体重变化。（E）不同处理后原发肿瘤（E,F）和远处肿瘤（E,G）中CD3⁺和CD8⁺ T细胞的免疫荧光染色图像和相应定量分析。（H）LDH@PSB联合RT和anti-PD-1治疗协同抗肿瘤免疫效应的拟议机制示意图。