K8·凯发(中国)

针对上述问题，北京大学第三医院超声医学科王淑敏教授、梁晓龙研究员团队构建了一种集神经免疫调控、活性氧清除与主动靶向功能于一体的协同治疗平台（MCF@CA），以实现局部增效、全身减毒的治疗效果。具体而言，将具有抗氧化活性的锰卟啉（MnP）与具有免疫调节功能的降钙素基因相关肽（CGRP）顺利获得酰胺化反应共价偶联，形成两亲性分子（MC）；随后将MC与叶酸修饰的DSPE-PEG共组装成靶向纳米颗粒（MCF NPs），并将其包载于超声控释型钙交联海藻酸钠水凝胶中，构建成MCF@CA系统。体外实验及糖尿病小鼠创面模型治疗研究表明，MCF@CA系统具有优异的活性氧清除能力、免疫调节作用、成纤维细胞功能改善及促血管生成能力，能够显著加速糖尿病创面的愈合进程。该文章于2026年1月21日以《Ultrasound Controlled-Release Hydrogel Promotes Diabetic Wound Healing via Neuroimmune Modulation and Synergistic ROS Scavenging》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202516882）。

方案1. MCF@CA 结构单元与制备流程示意图，及其用于糖尿病创面的治疗机制

（1）MCF@CA的合成与表征

MnP顺利获得酰胺化反应与CGRP共价偶联形成两亲性分子MnP-CGRP（MC）（图1A）。5-(4-羧基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉与氯化锰经螯合反应合成锰卟啉（MnP），紫外-可见光谱显示吸收峰由438 nm移至475 nm（图1B），卟啉固有荧光消失（图1C）。MC与DSPE-PEG2K-FA经乙醇注入法制备为自组装纳米颗粒MCF，动态光散射测得平均水合粒径为48.56±3.67 nm，平均Zeta电位为32.62±0.68 mV，透射电镜显示粒径为23.50±4.92 nm（图1D），DLS粒径较大归因于溶液中的水合层及溶剂化效应。能谱分析证实MCF NPs中含有锰和硫元素（图1E）。将MCF NPs分散于3%海藻酸钠溶液中，以60 mM钙盐作为交联剂构建MCF@CA水凝胶。对比CaCl₂、CaSO₄和CaCO₃三种钙盐的成胶时间：CaSO₄因溶解度低、Ca²⁺缓慢释放，可在5分钟内形成水凝胶（图1F），赋予体系初始混合阶段的可注射性（图1G）；CaCl₂因溶解度高而瞬间成胶，难以适应不规则创面形态及深层注射；CaCO₃因不溶性无法交联（图1F）。扫描电镜显示，随超声功率增加，水凝胶表面交联网络逐步被破坏（图1H）。体外释放实验以PBS模拟组织液、每日超声3 min，结果显示MCF NPs的释放速率随超声功率升高而增加（图1I），证实MCF@CA水凝胶可根据治疗需求调节释药速度。

图1. MCF 纳米颗粒与 MCF@CA 的制备及表征。(A) MCF纳米颗粒的制备原理示意图；(B) 卟啉、锰卟啉（MnP）及锰卟啉-降钙素基因相关肽（MnP-CGRP）的紫外-可见吸收光谱；(C) 卟啉与锰卟啉的荧光光谱；(D) MCF纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像，以及顺利获得动态光散射测得的流体力学粒径与Zeta电位；(E) MCF纳米颗粒的能谱（EDS）测试结果；(F) 海藻酸钠与不同钙盐混合制备水凝胶的凝胶化时间对比；(G) 以硫酸钙为钙离子供体的水凝胶，在初始交联阶段具备可注射性能；(H) 不同声功率（0、0.1、0.3、0.5、1.0 W/cm²）超声辐照后，MCF@CA水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图像；(I) 不同声功率超声辐照下水凝胶中MCF纳米颗粒的累积释放率。

（2）叶酸改善 MCF 纳米颗粒的体内药代动力学行为

流式细胞术显示，FITC标记的MCF NPs在LPS诱导的M1型RAW 264.7巨噬细胞中的摄取在4 h内快速增加，12 h达到饱和（图2A,B）；以DSPE-PEG2K替代DSPE-PEG2K-FA制备的纳米颗粒摄取显著降低，游离叶酸预处理后，流式细胞术证实摄取同样减少（图2C,D）。共聚焦显微镜显示，与无FA组相比，含DSPE-PEG2K-FA的纳米颗粒在12 h后细胞内荧光强度更高（图2E,G）。Cy5.5标记的体内滞留实验显示，MCF@CA应用于Leprdb/db小鼠创面后，12 h时MCF NPs与无FA的非靶向纳米颗粒滞留无显著差异；48 h时无FA组荧光强度降低一半，而含FA的MCF NPs在72 h仍维持高荧光强度（图2F,H）。

图2. MCF@CA 的细胞摄取与滞留特性。(A) 采用流式细胞术检测RAW 264.7细胞对MCF纳米颗粒的时间依赖性摄取行为；(B) RAW 264.7细胞与MCF纳米颗粒共培养后，FITC阳性细胞占比的时间梯度定量分析；(C) RAW 264.7细胞分别与无靶向纳米颗粒（MC纳米颗粒）、MCF纳米颗粒、叶酸受体封闭的MCF纳米颗粒孵育12 h后，细胞摄取效果的流式细胞术对比；(D) MC纳米颗粒、MCF纳米颗粒及叶酸受体封闭MCF纳米颗粒孵育12 h后，FITC阳性细胞占比定量统计；(E) 激光共聚焦显微镜图像对比RAW 264.7细胞孵育12 h后对MC纳米颗粒与MCF纳米颗粒的胞内摄取情况，并进行荧光强度定量分析(G)；(F) 利用活体成像系统对比MCF纳米颗粒与非靶向纳米颗粒在糖尿病小鼠创面的滞留动力学差异，并完成荧光强度定量分析(H)。

（3）MCF@CA清除活性氧，促进成纤维细胞增殖与迁移

体外实验证实，MnP经与CGRP共价偶联并自组装为纳米颗粒后，仍保留类似天然超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，可催化分解O₂^-和H₂O₂（图3B,C）；MCF NPs分解H₂O₂产生的溶解氧水平随浓度升高和反应时间延长而逐渐增加（图3D），该氧气生成可改善细胞内缺氧。以H₂O₂（100 µM，4 h）构建氧化应激细胞模型，DCFH-DA探针检测显示，PBS组RAW 264.7巨噬细胞（图3E,F）和RS1成纤维细胞（图3H,I）经H₂O₂处理后绿色荧光显著增强，提示细胞内ROS水平升高；单独超声或游离CGRP均无法清除细胞内ROS，而MCF@CA处理12 h后两组细胞ROS水平均显著降低，且清除效果优于游离MnP。经游离MnP或MCF@CA条件培养基处理后，RS1细胞增殖恢复（图3J），其中MCF@CA+US组因超声促进水凝胶降解释放更多MCF NPs，ROS清除能力最优。划痕实验显示，PBS组成纤维细胞36 h后创面愈合率仍低于40%，游离MnP或单纯MCF@CA组迁移速度有所增加，而MCF@CA+US组36 h内实现完全创面闭合（图3G,K）。综上，MCF@CA具有SOD样和CAT样活性，可顺利获得清除ROS改善高糖诱导的细胞氧化应激，进而促进成纤维细胞增殖和迁移。

图3. MCF@CA活性氧清除能力及其对成纤维细胞作用的体外验证。(A) 细胞实验示意图；(B) 采用过氧化氢酶检测试剂盒测定MCF纳米颗粒的类过氧化氢酶活性；(C) 采用超氧化物歧化酶检测试剂盒测定MCF纳米颗粒的类超氧化物歧化酶活性；(D) 不同浓度（0、50、100、200 μg/mL）MCF纳米颗粒分解过氧化氢的产氧量；(E)、(H) 不同处理条件下，过氧化氢诱导的RAW 264.7细胞内活性氧荧光成像图；(F)、(I) 不同处理条件下，过氧化氢诱导的RS1细胞内活性氧荧光成像图；(G)、(K) 划痕实验检测不同处理组RS1细胞的迁移能力；(J) 不同处理条件下，过氧化氢损伤RS1细胞的细胞活力（以未处理RS1细胞为对照组）。

（4）MCF@CA体外促进巨噬细胞表型极化转换

以小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）为模型，LPS诱导M1极化，H₂O₂模拟氧化应激，IL-4诱导M2极化作为对照，流式细胞术检测CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）显示：单独超声、游离CGRP或游离MnP对巨噬细胞表型调控作用较弱，CD86⁺细胞比例虽有所下降但仍高于60%，CD206⁺细胞比例虽有所增加但仍低于50%；无超声的水凝胶组因MCF NPs释放不足，亦无法有效调控巨噬细胞表型；而MCF@CA条件培养基组CD86⁺ M1型细胞比例显著降低，CD206⁺ M2型细胞比例显著升高（图4A-C）。非靶向纳米颗粒（MC@CA）与MCF@CA对巨噬细胞的调控效果相似，因表型调控需持续48 h，已超过MCF NPs摄取饱和时间（12 h），此时细胞内纳米颗粒浓度均已达到有效水平。Western blot显示，与对照组相比，H₂O₂处理显著下调巨噬细胞RAMP-1表达，而游离MnP、MC@CA或MCF@CA均可上调RAMP-1表达，其中MCF@CA效果最显著（图4D）。ELISA检测细胞因子分泌显示：LPS+H₂O₂刺激后巨噬细胞大量分泌促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6，几乎不表达抗炎因子IL-10；单独超声可部分降低促炎因子分泌并增加IL-10分泌，但效果有限；游离MnP或CGRP处理较超声组细胞因子变化更为明显；MCF@CA+US组促炎因子分泌最少、IL-10分泌最多（图4E-J）。此外，超声、游离MnP或游离CGRP均可一定程度增加巨噬细胞TSP-1分泌，而MCF@CA+US组TSP-1分泌显著高于其他各组（图4J）；MC@CA+US组及无超声释放的MCF@CA组TSP-1分泌均低于MCF@CA+US组，提示该效应具有剂量依赖性。MCF@CA同时增加了巨噬细胞促血管生成因子VEGF-A的分泌（图4G）。

图4. MCF@CA调控巨噬细胞表型的体外验证。(A) 不同处理条件下，巨噬细胞M1型标志物（CD86）与M2型标志物（CD206）的流式细胞术分析；(B) 不同处理组CD86阳性细胞占比的定量分析；(C) 不同处理组CD206阳性细胞占比的定量分析；(D) 蛋白质印迹法（Western Blot）检测不同处理条件下巨噬细胞中RAMP-1蛋白的表达水平；(E–J) 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测不同处理组巨噬细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、血小板反应蛋白-1（TSP-1）及血管内皮生长因子（VEGF）的分泌水平。

（5）MCF@CA作用于巨噬细胞的潜在机制

RNA测序比较MCF@CA处理的M1型巨噬细胞与对照组的mRNA差异，主成分分析显示两组间存在显著整体转录差异（图5A）。火山图显示MCF@CA处理产生943个差异表达基因，其中480个上调、463个下调（图5B），热图展示其表达模式（图5C）。KEGG通路富集分析显示，MCF@CA上调与AMPK信号通路相关的基因，并观察到过氧化物酶体相关基因上调；同时下调NOD样受体、NF-κB、TNF及趋化因子等促炎信号通路相关基因的转录（图5D-F），上述结果与RNA测序分析及细胞因子分泌变化（图4E,F）一致。

图5. MCF@CA 处理组的转录组测序结果分析。(A) 差异表达基因的主成分分析（PCA）；(B) 差异表达基因火山图；(C) 差异表达基因（DEGs）热图；(D) KEGG富集条目及其对应前十位差异基因的弦图；(E) 上调基因的KEGG富集分析；(F) 下调基因的KEGG富集分析。

（6）MCF@CA促进糖尿病小鼠创面愈合

以8-10周龄Leprdb/db糖尿病小鼠建立全层皮肤缺损创面模型（直径6 mm），于伤后第1、4、7天给药，第10天取材（图6A）。伤后前4天内，除MC@CA和MCF@CA+US组外，其余各组均未显示出显著促愈合趋势，后期观察中，MCF@CA+US组创面闭合率最高，达到PBS组的2倍，部分创面完全闭合，MCF@CA疗效优于非靶向纳米颗粒（MC@CA），无超声应用的MCF@CA组创面闭合率显著低于超声触发释放组（图6B,C）。H&E染色显示，PBS组和单独超声组创面完全开放，深层结缔组织暴露；游离CGRP、MnP或无超声MC@CA组创面有不同程度肉芽组织覆盖但未完全闭合；MC@CA+US和MCF@CA+US组创面完全愈合，其中MCF@CA+US组皮肤覆盖完整（图6D）。Masson三色染色评估胶原沉积显示，PBS组和单独超声组因创面完全破裂无法评估；与其他组相比，MCF@CA+US组愈合后胶原沉积显著增多（图6E）。

图6. 动物实验验证MCF@CA对糖尿病创面愈合的促进作用。(A) 动物实验流程示意图；(B) 不同处理条件下小鼠创面的代表性大体照片；(C) 各组创面愈合率的定量分析；(D) 各组小鼠创面组织苏木精-伊红（H&E）染色代表性切片；(E) 各组小鼠创面组织马松三色染色代表性切片。

免疫荧光检测显示，PBS、单独超声、游离CGRP或游离MnP处理组创面富含促炎M1型巨噬细胞；而MC@CA或MCF@CA处理组肉芽组织内巨噬细胞表型发生逆转，主要呈现抗炎M2表型。与MC@CA组相比，MCF@CA+US组M2型巨噬细胞比例更高（图7A,B）。血管标志物免疫荧光显示，MCF@CA+US组血管内皮标志物CD31表达显著增加，荧光面积增至PBS组的300%以上，并可见明显管状结构（图7A,C）；α-SMA（标记血管平滑肌细胞）染色显示该组具有平滑肌覆盖的血管数量超过PBS组的30倍（图7A,D）。MCF@CA+US有效提高了创面闭合率，增加了胶原沉积，促进巨噬细胞向抗炎表型极化，增加血管密度并促进具有平滑肌覆盖的较大血管形成。

图7. 免疫荧光染色阐明MCF@CA促进创面愈合的作用机制。(A) 不同处理组糖尿病小鼠创面组织中CD31、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及CD86（红色）+CD206（绿色）的免疫荧光染色图像；(B) CD31染色荧光面积的定量分析；(C) α-SMA染色荧光面积的定量分析；(D) CD206/CD86荧光面积比值的定量分析。

（7）MCF@CA的生物相容性评价

CCK-8实验显示，MCF NPs和MCF@CA在10 µg/mL浓度下（远超MCF NPs有效治疗浓度100 ng/mL），HUVEC细胞存活率仍高于80%，未随药物浓度增加而显著降低（图8A,B）。糖尿病小鼠治疗期间各组体重无显著差异（图8C）。溶血实验证实100 µg/mL的MCF NPs和MCF@CA未引起明显溶血（图8D）。主要脏器H&E染色显示，除各组肝脏均存在因糖尿病小鼠代谢异常导致的自发性脂肪肝细胞内脂肪空泡外，治疗组内脏器官组织学结构未见其他异常（图8E）。

图8. MCF纳米颗粒与MCF@CA的生物相容性评价。(A) 采用CCK-8 法检测不同浓度MCF纳米颗粒与MCF@CA处理24 h后RAW 264.7细胞的细胞活力；(B) 采用CCK-8法检测不同浓度MCF纳米颗粒与MCF@CA处理24 h后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞活力；(C) 治疗周期内不同处理组小鼠的体重变化；(D) MCF纳米颗粒与MCF@CA的溶血实验检测；(E) 治疗结束后，不同处理组小鼠主要脏器组织的H&E染色切片。