K8·凯发(中国)

针对上述问题，华南理工大学施雪涛教授与中山大学光华口腔医学院黄舒恒教授、林正梅教授联合研究团队开发了一种粘附性多功能微针-纳米片（MN）复合膜。该膜以聚乙烯醇（PVA）-聚己内酯（PCL）-明胶甲基丙烯酰（GelMA）三层纳米片为基底，顺利获得PVA瞬时溶解实现纳米尺度湿粘附与物理密封；GelMA层加速降解释放接枝抗菌肽Tet213（KRWWKWWRRC）杀灭牙周致病菌；微针阵列缓慢降解释放牙髓干细胞（DPSCs）来源外泌体，驱动巨噬细胞M2极化、促进成骨与血管新生。该"粘附+物理屏障+多功能协同"整合策略为炎症性牙周骨缺损的精准修复给予了新范式。该文章于2026年3月26日在线发表，以《Adhesive Microneedle-Nanosheets With Temporally Orchestrated Antimicrobial, Immunomodulatory, and Osteogenic Functions for Periodontal Regeneration》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.72919）。

图1. MN结构设计与PD微环境中牙槽骨再生应用示意图

（1）MN的合成与机械表征

MN采用顺序旋涂结合3D打印技术一体化制备，纳米片由PVA底层、PCL中间层和AMP接枝GelMA上层构成，微针以ACG/GelMA混合水凝胶负载外泌体。PCL层厚59.8 nm、GelMA层厚35.7 nm，总厚度95.5 nm；AFM显示PCL光滑致密、GelMA粗糙。DMA模量超越牙周软组织范围（0.01–0.1 MPa），爆破压力超人体血压（10–16 kPa）。微针G4配方（10% GelMA+20% ACG）Young's modulus达18.24±1.08 MPa，膨胀率600%。外泌体TEM呈双层囊泡、NTA峰值~130 nm、标志物阳性，DiD标记针尖富集，持续释放且7天结构完整。MN穿透猪皮形成~200 μm微通道，RhB扩散>300 μm，小鼠微伤口1 h闭合。PVA溶解后纳米片实现"无缝"顺应粘附，180°剥离强度显著高于CM，CM组7天即有细胞穿透而MN组几乎无细胞穿越。

图2. MN制备与理化表征。（A）制备示意图与光学照片；（B）FITC-AMPs CLSM均匀分布；（C）光学轮廓仪各层厚度定量（PCL 59.8 nm，GelMA 35.7 nm）；（D）AFM表征PCL光滑致密与GelMA粗糙形貌；（E）SEM示纳米片-猪皮界面顺应接触；（F）MN阵列SEM形态；（G）DiD-外泌体荧光分布与针尖富集；（H）PBS中体外累积释放曲线；（I）万能试验机应力-位移曲线；（J）H&E示猪皮微通道（~200 μm）；（K）MN应用示意图；（L）CM与MN扭转应力粘附对比；（M）14天抗细胞侵入屏障评估。

（2）MN的体外抗菌性能与生物相容性评价

MN对P. g、A. a、MRSA及E. coli的抗菌效能评估显示：AN和MN组OD600接近无菌空白，标准平板计数未见可见菌落，活菌被完全消除。Live/Dead检测示AN和MN组以红色死细胞为主；SEM显示AN和MN组细菌膜皱缩、穿孔及胞内内容物泄漏；结晶紫染色示AN和MN组有效破坏生物膜。Tet213顺利获得物理破坏细胞膜/生物膜及抑制胞内蛋白合成发挥双重杀菌机制。CCK-8示mBMSCs、L929和RAW 264.7在各组增殖活性与Ctrl相当，MN效果优于CM且显著优于BN和AN；活/死染色示各组绿色荧光强度高、细胞密度大。溶血率低于5%安全阈值；皮下移植示MN与CM均未对大鼠重要器官造成显著毒性。

图3. MN抗菌、抗炎与成骨特性。（A）MN抗菌-抗炎-成骨机制示意图；（B）CFU测定P. g、A. a、E. coli和MRSA抗菌活性；（C）SEM示四种细菌经不同材料处理后的形态变化；（D）RAW 264.7促炎/抗炎细胞因子mRNA表达；（E,F）M1/M2极化标志物调控及荧光强度统计；（G,H）mBMSCs成骨与血管生成蛋白Western blot及GAPDH归一化定量；（I,J）ALP活性与ARS钙沉积染色及半定量分析。（n=3，mean±SD，p<<0.0001，*p<<0.001，p<<0.01，*p<<0.05）。对照组：Ctrl、LPS、LPS+BN、LPS+AN、LPS+MN。

（3）MN的体外与体内抗炎能力 

以10 μg mL⁻¹ P. g来源LPS刺激24 h建立RAW 264.7炎症模型，RT-qPCR示LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高，免疫荧光示CD86和iNOS高表达。材料提取物处理后，MN组IL-1β、IL-6和TNF-α表达与CM相当但显著低于BN和AN；IL-4、IL-10和Arg-1显著高于CM、BN和AN。免疫荧光示MN组CD86和iNOS显著低于其他组（CD86与CM无显著差异），CD206和Arg1显著高于其他组。大鼠皮下植入21天H&E示各组无生物纤维化或纤维囊腔，MN组材料部分可见；免疫组化示MN和CM组iNOS下调、CD206上调，MN组更显著。Tet213与外泌体协同顺利获得抑制NF-κB及ROS-MAPK-NFκB P65通路促进M2极化，抗炎效果优于CM。

（4）MN的体外成血管/成骨性能评价

划痕实验示24 h后MN组细胞迁移显著增强，迁移率排序为MN > CM > AN > BN > Ctrl。Matrigel管腔形成实验示CM组无管腔形成，MN组血管网络发育最 robust，内皮细胞连接点和成熟管状结构数量最高；DPSCs外泌体顺利获得激活细胞迁移信号通路促进血管新生。Western blot示14天各组成骨标志物（COL1A、RUNX2、OPN、OCN）和VEGFA显著上调，MN组显著高于所有其他组（CM、BN和AN相对于Ctrl无显著矿化促进效应）；ALP和ARS染色示MN组染色强度最强（p < 0.05）。MN内DPSCs外泌体顺利获得microRNA-27a抑制DKK3、激活Wnt/β-catenin和BMP-SMAD1/5通路，并携带BMP-2和RUNX2直接启动成骨；缺氧预处理外泌体上调VEGF和HIF-1α，增加HUVECs管腔形成和血管分支，协同促进成骨与成血管。

（5）MN治疗效果的体内评价

大鼠模型中，正畸丝结扎4周创建上颌牙周缺损后再行4周GBR，micro-CT示PD组根分叉暴露、牙槽骨显著丧失；MN和CM组BV/TV显著升高（p < 0.01 vs. CM），牙槽骨高度显著再生。H&E示MN和CM组CEJ-to-alveolar crest距离缩短；Masson三色示MN和CM组胶原纤维排列粗而有序，BN和AN组紊乱碎片化；TRAP示PD组破骨细胞浸润明显，MN组抑制最显著。免疫荧光示MN组iNOS⁺（M1）减少、CD206⁺（M2）增加，优于CM组；血管样结构MN组长而粗、壁厚；RUNX2⁺细胞MN组荧光最强，证实成骨细胞样细胞形成。MN顺利获得M2极化逆转破骨-成骨失衡、促进血管新生及MSCs趋化。比格犬6×5×3 mm缺损模型3个月后，micro-CT示CM和MN组均显著牙槽骨再生，MN组优于CM组（p < 0.05 vs. blank）；Masson三色示MN组胶原纤维显著有序，CM组碎片化，空白对照无再生组织。

图4. 大鼠牙周缺损8周体内评价。（A）上颌第一磨牙结扎诱导PD及治疗干预示意图；（B,C）micro-CT扫描、3D重建及BV/TV定量；（D,E）CT横截面与CEJ-牙槽嵴距离统计；（F,G）H&E染色及组织病理学评分；（H）Masson三色（胶原排列）和TRAP染色（破骨细胞，箭头示多核TRAP⁺细胞）；（I,J）CD86/CD206、CD31、OCN免疫荧光及定量。（n=3，mean±SD，ns：无显著性，p<<0.0001，*p<<0.001，p<<0.01，*p<<0.05）。

图5. 比格犬植入12周评价。（A）牙周缺损手术及支架植入；（B）micro-CT 3D重建、冠状面与轴位面分析牙槽骨再生；（C）H&E细胞形态与Masson三色胶原沉积组织学评价；（D）BV/TV、Tb.N、Tb.Sp定量。（n=3，mean±SD，ns：无显著性，p<<0.0001，*p<<0.001，p<<0.01，*p<<0.05）。

（6）抗菌、抗炎与成骨分化的机制

16S rRNA测序示PD组α多样性显著高于Health组，CM和MN组显著降低；PCoA示CM和MN组分布接近。门水平上Health组以Proteobacteria和Firmicutes为主，PD组Bacteroidota显著增加（P. g增殖），CM和MN组Proteobacteria恢复、Bacteroidota下降，群落结构接近Health。LEfSe示Health组优势为Corynebacteriaceae和Streptococcaceae，PD组Bacteroidales延长、共生菌缩短，CM组致病菌下降，MN组Proteobacteria突出（如Aeromonadales参与氮循环）。RNA-Seq示CM vs. PD有615个DEGs，MN vs. PD有355个DEGs，共同187个；CM主要激活抗菌/炎症/免疫应答通路，MN额外激活T细胞应答和抗革兰氏阴性菌通路，且DEGs特异性富集于成骨、抗炎和血管生成再生通路。GSEA示MN组在细菌抗性、新生血管形成、免疫应答和胶原生物合成中极高富集。MN顺利获得激活先天/适应性免疫、恢复免疫稳态、缓解炎症并触发再生修复实现牙周组织再生。

图6. 16S rRNA与RNA-seq测序分析。（A）Shannon和Simpson指数评估口腔菌群α多样性；（B）PCoA展示微生物群落差异；（C）门水平相对丰度；（D）Circos图可视化分类组成；（E）CM vs. PD和MN vs. PD交集DEGs维恩图；（F）各组DEGs火山图；（G,H）CM vs. PD（G）和MN vs. PD（H）的KEGG富集分析；（I）GSEA揭示MN组基因集富集评分。