K8·凯发(中国)

研究背景：

（1）外泌体纳米马达的制备与表征

采用生物矿化法合成MnO₂纳米颗粒，TEM显示其呈均匀球形，平均直径约70 nm（图2B），在H₂O₂存在下产生可见气泡（图2C）。软骨靶向肽CAP经酰胺化反应偶联至DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL并经¹H-NMR和FT-IR验证，修饰后ζ电位升高约2 mV；MnO₂纳米颗粒经超声以1:1数量比封装入CAP-mExos，再与bExos经"孵育-挤压"策略膜融合，FRET效率约70%（图2D、E）。Western blot显示bExos和mExos高表达ALIX、TSG101和CD81而不表达Calnexin（图2F、G）；NTA显示粒径主要分布于90–150 nm（图2H）；XPS检出640 eV和655 eV处特征性Mn 2p峰（图2I）；ICP-OES显示Mn含量分别达3.42%和3.45%，包封率升至87.8%和88.4%（图2J）；纳米马达在模拟滑液及OA样微环境中7天内保持稳定（图2K、L）。

图2. 外泌体纳米马达的制备与表征。a) 外泌体纳米马达制备流程示意图。b) MnO₂纳米颗粒的TEM图像，比例尺 = 50 nm。c) MnO₂纳米颗粒的催化活性，加入H₂O₂后产生气泡。d) 采用孵育、挤压及"孵育-挤压"联合方法进行外泌体间膜融合的FRET分析。e) FRET比率和FRET效率的定量评估（每组n = 3个生物学重复）。f,g) 外泌体标志蛋白ALIX、TSG101、CD81和Calnexin的Western blot分析。h) 代表性TEM图像显示形貌，NTA分析显示粒径分布，比例尺 = 100 nm。i) 锰化学态的XPS分析。j) 不同外泌体制剂中锰含量及包封率的ICP-OES定量（每组n = 3个生物学重复）。k) OA相关微环境条件下DiI标记的CAP-Mn@hyExos在7天内的荧光释放（每组n = 3个生物学重复）。l) OA相关微环境条件下CAP-Mn@hyExos水动力学粒径在7天内的DLS分析（每组n = 3个生物学重复）。

（2）ROS响应性运动实现深层软骨渗透

NTA轨迹显示，无H₂O₂时各组呈典型布朗运动，H₂O₂处理后含MnO₂的CAP-Mn@mExos和CAP-Mn@hyExos轨迹显著延长、平均速度增加（图3B、C）；Y形微流控芯片中纳米马达优先富集于H₂O₂腔室，且仅对ROS相关刺激产生响应。离体软骨模型中，CAP-Mn@mExos和CAP-Mn@hyExos在6天时渗透深度达约140 μm，较非马达组提高约4倍（图3D、E）；无CAP的Mn@hyExos渗透较弱，提示ROS响应性运动是深层渗透的主要贡献者，CAP结合进一步增强局部蓄积。流式细胞术显示纳米马达组胞内荧光强度约为mExos和bExos的2.5倍（图3F–I）；IVIS显示两组在两周后仍保留约30%初始荧光（图3J、K）。体内分布显示锰主要位于关节、脾和肾，8周时基本清除，脑组织无异常蓄积，表明良好的清除能力和全身安全性。

图3. ROS响应性外泌体纳米马达实现深层软骨渗透、增强细胞摄取并延长关节滞留。a) ROS响应性运动增强外泌体纳米马达在氧化微环境中运动的示意图。b,c) 有无H₂O₂条件下各外泌体制剂的代表性NTA追踪轨迹及平均粒子速度的定量分析（每组n = 20个生物学重复）。d,e) DiI标记的外泌体制剂孵育2、4、6天后的离体软骨切片共聚焦显微镜图像及荧光渗透深度的定量分析，比例尺 = 50 μm（每组n = 3个生物学重复）。f,g) 与DiI标记的外泌体制剂共孵育的软骨细胞共聚焦显微镜图像及胞内荧光强度的定量分析，比例尺 = 20 μm（每组n = 3个生物学重复）。h,i) 流式细胞术定量外泌体被软骨细胞内化的情况（每组n = 3个生物学重复）。j,k) DiI标记的外泌体关节腔注射入大鼠OA关节后的活体成像（IVIS）及随时间变化的荧光滞留相对定量分析（每组n = 3个生物学重复）。

（3）140@bExos的制备及外泌体制剂的生物相容性与生物活性评价

顺利获得慢病毒转导构建miR-140过表达BMSCs并分离140@bExos（图4A），最佳转导条件为MOI = 100联合Hitrans A试剂（图4B、C）。qPCR证实转染组BMSCs中miR-140显著上调，且与140@bExos共培养后软骨细胞内miR-140水平显著升高（图4D、E）。与OA对照相比，140@bExos显著上调COL2A1并降低MMP13和iNOS，免疫荧光、Western blot、qPCR及阿利新蓝、番红O染色结果一致。将140@bExos与CAP-Mn@mExos膜融合制备CAP-Mn/140@hyExos（图4A）。活/死染色和溶血试验显示各制剂生物相容性良好（图4F、附图32）；CAP-Mn/140@hyExos干预后OA软骨细胞形态恢复最显著（图4G）；CCK-8显示各制剂显著促进软骨细胞增殖（图4H）；划痕实验显示CAP-Mn/140@hyExos促迁移能力最强（图4I、J）。

图4. 140@bExos的制备及外泌体制剂生物相容性和生物活性的评价。a) 140@bExos的制备及CAP-Mn/140@hyExos构建过程示意图。b,c) 慢病毒转导条件优化的共聚焦显微镜成像及转导效率的定量分析，比例尺 = 200 μm（每组n = 3个生物学重复）。d) qPCR分析BMSCs中miR-140的表达水平（每组n = 3个生物学重复）。e) qPCR评估与140@bExos共培养后软骨细胞中miR-140的表达（每组n = 3个生物学重复）。f) 不同外泌体制剂处理OA软骨细胞的活/死染色代表性荧光图像，比例尺 = 200 μm。g) 不同外泌体制剂处理OA软骨细胞的细胞骨架染色代表性荧光图像，比例尺 = 25 μm。h) CCK-8法评估不同外泌体制剂处理OA软骨细胞的增殖（每组n = 3个生物学重复）。i,j) 划痕实验评估不同外泌体制剂处理软骨细胞的迁移及迁移率的定量分析，比例尺 = 500 μm（每组n = 3个生物学重复）。

（4）外泌体纳米马达的抗氧化能力

采用100 μM H₂O₂建立软骨细胞氧化应激模型。DCFH-DA染色显示H₂O₂显著升高胞内ROS，140@bExos仅中度降低ROS，而含MnO₂的CAP-Mn@hyExos和CAP-Mn/140@hyExos显著减弱ROS蓄积（图5B、C）；JC-1染色显示上述两种制剂有效恢复H₂O₂诱导的线粒体膜电位下降（图5D、E）；Annexin V/PI凋亡实验显示两者显著降低总凋亡率（图5F、G），活/死染色显示活细胞比例显著提高（图5H、I）；此外，两种制剂显著提高SOD和CAT活性并降低MDA水平（图5K）。上述结果表明，含MnO₂制剂顺利获得清除胞内ROS、保护线粒体功能、抑制凋亡并增强抗氧化酶活性，有效保护软骨细胞免受H₂O₂诱导的氧化损伤。

图5. 外泌体纳米马达的抗氧化能力。a) H₂O₂诱导的氧化应激模型及相应实验流程示意图。b,c) DCFH-DA染色检测不同外泌体制剂处理软骨细胞的胞内ROS及定量分析，比例尺 = 200 μm（每组n = 3个生物学重复）。d,e) JC-1染色评估线粒体膜电位及相对定量分析，比例尺 = 100 μm（每组n = 3个生物学重复）。f,g) Annexin V/PI流式细胞术检测凋亡及凋亡率的定量分析（每组n = 3）。h,i) 不同外泌体制剂处理软骨细胞的活/死染色及细胞活力定量分析，比例尺 = 200 μm（每组n = 3个生物学重复）。j) 软骨细胞中氧化应激相关生物标志物评估示意图。k) 不同外泌体制剂处理软骨细胞胞内SOD、CAT活性和MDA水平的定量分析（每组n = 3个生物学重复）。

（5）外泌体纳米马达促进OA软骨细胞功能恢复

qPCR分析显示，CAP-Mn@hyExos处理中度上调COL2a1并降低MMP13和iNOS，而140@bExos和CAP-Mn/140@hyExos显著恢复COL2a1表达并抑制MMP13和iNOS，其中CAP-Mn/140@hyExos效果最显著（图6A）；免疫荧光和Western blot证实，140@bExos和CAP-Mn/140@hyExos在蛋白水平显著上调COL2A1并下调MMP13和iNOS（图6B–F）；阿利新蓝和番红O染色显示，两种制剂干预明显增强蛋白聚糖沉积（图6G、H）。上述结果表明，CAP-Mn/140@hyExos顺利获得miR-140递送与微环境响应性运输的联合效应，有效促进OA软骨细胞表型恢复。

图6. 外泌体纳米马达促进OA软骨细胞功能恢复。a) COL2a1、MMP13和iNOS基因表达水平的qPCR分析（每组n = 4个生物学重复）。b–d) COL2A1、MMP13和iNOS的代表性免疫荧光图像及相应定量分析示意图，比例尺 = 50 μm（每组n = 3个生物学重复）。e,f) COL2A1、MMP13和iNOS蛋白水平的Western blot分析及相对定量分析（每组n = 3个生物学重复）。g,h) 不同外泌体制剂处理OA软骨细胞的番红O和阿利新蓝染色及相关定量分析，比例尺 = 200 μm（每组n = 3个生物学重复）。

（6）外泌体纳米马达改善膝骨关节炎大鼠步态并恢复软骨下骨微结构

在ACLT+DMM法建立的大鼠膝OA模型中评估疗效（图7A）。步态分析显示，各组平均步幅长度无统计学差异，CAP-Mn/140@hyExos对步频和行走速度的改善最为显著，三种制剂均显著改善患肢足底压力分布，以CAP-Mn/140@hyExos组最明显（图7B、C）。micro-CT显示OA标本软骨下骨裂隙伴硬化、骨小梁稀疏紊乱、关节间隙变窄及骨赘形成（图7D、E、H）；定量分析显示OA动物BMD、Tb.N和Tb.Th显著降低而Tb.Sp升高，各治疗组均部分恢复上述参数并减少骨赘，其中CAP-Mn/140@hyExos组改善最有效（图7I）。

图7. 外泌体纳米马达改善膝OA大鼠步态并恢复软骨下骨微结构。a) OA大鼠模型实验治疗时间线示意图。b) OA大鼠的代表性步态截图及足印路线图（红色箭头示手术侧足印）。c) 手术侧后足的足底压力三维热图。d) 胫骨软骨下骨微结构的显微CT水平面视图。e,h) 患膝关节三维重建及骨赘数量的定量分析（每组n = 4个生物学重复）。f) 胫骨平台软骨下骨微结构的三维形态计量学分析。g) 步态参数定量分析，包括步幅长度、步频、行走速度和足底压力（每组n = 4个生物学重复）。i) 胫骨软骨下骨BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp的显微CT定量分析（每组n = 4个生物学重复）。

（7）外泌体纳米马达促进软骨修复并延缓膝OA大鼠疾病进展

大体形态显示，OA组关节软骨表面不规则、局灶性侵蚀伴软骨下骨暴露，140@bExos和CAP-Mn/140@hyExos干预后形态恢复更显著，后者大体观结局最佳。组织学染色显示，OA软骨表面龟裂、软骨变薄、软骨细胞密度降低、潮线结构破坏；各外泌体干预均减轻软骨退变并显著降低OARSI评分，其中CAP-Mn/140@hyExos组再生软骨厚度接近甚至超过Sham组（图8A–F）。免疫组化显示，CAP-Mn/140@hyExos有效恢复OA软骨中降低的COL2A1并抑制升高的MMP13和iNOS（图8G–I）。生物安全性评估显示，各治疗组血液学参数及肝肾功能标志物无显著改变，主要器官H&E染色未见病理改变，提示外泌体纳米马达具有良好的生物相容性。

图8. 外泌体纳米马达促进软骨修复并延缓膝OA大鼠疾病进展。a–c) 不同外泌体制剂处理患OA关节的代表性组织学染色，包括苏木精-伊红（a）、番红O-固绿（b）和甲苯胺蓝（c），比例尺 = 200 μm。d–f) 软骨厚度（d）、软骨细胞数量（e）和OARSI评分（f）的定量分析（每组n = 4个生物学重复）。g–i) 软骨组织中COL2A1（g）、MMP13（h）和iNOS（i）的代表性免疫组化染色，比例尺 = 200 μm。j–l) COL2A1（j）、MMP13（k）和iNOS（l）免疫组化表达的定量分析（每组n = 4个生物学重复）。

（8）转录组学分析揭示外泌体纳米马达治疗OA的潜在机制

给药后8周转录组学分析显示，CAP-Mn/140@hyExos治疗组与OA对照的基因表达谱明显分离（图9A），共鉴定出550个上调和1667个下调的差异表达基因（图9B）。GO富集分析显示DEGs显著富集于氧化解毒、氧化磷酸化及免疫调节通路（图9C、D），热图显示Prdx5、Gpx4、Ndufa8、Cox4i1等关键基因显著差异表达（图9E），PPI网络分析将其归为氧化解毒、氧化磷酸化和免疫调节三个功能簇（图9F）。分子验证显示，CAP-Mn/140@hyExos显著上调Prdx5和Gpx4、恢复Ndufa8和Cox4i1表达、下调Traf6和Ikbkg（图9G–I），且上述变化在软骨深层同样被观察到。综上，CAP-Mn/140@hyExos顺利获得协同增强氧化解毒、恢复线粒体能量代谢和抑制炎症反应，维持软骨细胞稳态并促进功能修复（图9J）。

图9. 转录组学分析揭示外泌体纳米马达治疗OA的潜在机制。a) OA对照与CAP-Mn/140@hyExos治疗软骨全局基因表达模式的层次聚类分析。b) 两组间DEGs的火山图，差异表达分析采用DESeq2（P < 0.05，|log2FC| > 1）。c) 显著富集的GO生物过程条目及其关联DEGs的弦图。d) 富集的GO分子功能和细胞组分条目及KEGG通路的气泡图汇总，GO和KEGG富集分析采用clusterProfiler进行。e) 与氧化解毒、氧化磷酸化和免疫调节通路相关选定DEGs的热图。f) 选定DEGs编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用网络。g) CAP-Mn/140@hyExos处理后OA软骨中主要通路代表性蛋白的免疫组化分析，比例尺 = 100 μm。h) 软骨细胞模型中相同蛋白的Western blot分析。i) 软骨细胞模型中相同基因的qPCR验证（每组n = 3个生物学重复）。j) CAP-Mn/140@hyExos治疗OA的拟议机制示意图。