K8·凯发(中国)

方案1. V-MBG微球合成及其在糖尿病创面治疗中的代谢调控与治疗应用的示意图

图1. V-MBG微球和GCP-V-MBG水凝胶的合成与理化表征。a) V-MBG微球的扫描电子显微镜（SEM）图像。b、c) V-MBG微球的透射电子显微镜（TEM）图像。d) V-MBG微球上V、Si、Ca和P的EDS元素 mapping。e) MBG和V-MBG微球的N₂吸附-脱附等温线。f) MBG和V-MBG微球的UV拉曼光谱。g) V-MBG微球浸泡于PBS中V离子浓度的变化。h) V-MBG@GCP水凝胶制备示意图。i) 干燥GCP-V-M水凝胶的SEM图像。j) GCP、GCP-M、GCP-V-M水凝胶的FTIR光谱。k) GCP、GCP-M、GCP-V-M水凝胶的流变学性能。l) 不同时间点的葡萄糖响应性V离子释放。m) 各种水凝胶浸泡于高浓度葡萄糖溶液（12 g/L）中的代表性图像。n) 葡萄糖响应性V离子释放示意图。

（2）GCP-V-MBG水凝胶对糖尿病创面的体内治疗效果

顺利获得高糖高脂饲料喂养联合低剂量链脲佐菌素（STZ）注射构建糖尿病小鼠模型（C57小鼠）。非靶向代谢组学分析显示非糖尿病（N-DM）与糖尿病（DM）组皮肤组织之间存在显著的代谢改变：糖尿病创面中酸性代谢物（特别是乳酸）显著积累，棕榈油酸显著降低，证实创面组织成功诱导出糖尿病相关代谢功能障碍。建立直径6 mm的全层背部创面后，与对照组、GCP组和GCP-M组相比，GCP-V-M组在所有时间点均显著加速创面闭合，愈合率达96.00±1.18%。H&E和Masson染色进一步验证：第3至12天GCP-V-M组创面长度最短；第3天和第6天该组表皮层和肉芽层更厚，提示更强的炎症应答和早期再生，第12天两层显著变薄，表明更快进入重塑期；胶原沉积也显著增加。单独使用V-MBG同样显著促进创面愈合并改善局部代谢谱。免疫组化（IHC）显示GCP-V-M组促炎细胞因子TNF-α和IL-6表达显著降低（钒离子驱动的抗炎作用最强），抗炎因子IL-10明显增加；CD31染色显示GCP-V-M组新生血管形成显著强于其他组。免疫荧光染色显示，第4天GCP-V-M组M2标志物CD206表达显著高于其他各组（P<0.01，包括GCP-M组），iNOS（M1标志物）降低，表明GCP-V-M水凝胶有效将巨噬细胞重编程为促再生M2表型。蛋白质组学分析鉴定出310个差异表达蛋白（DEPs），GO富集提示其调控炎症、能量代谢、表观遗传及免疫功能。综上，GCP-V-M不仅加速创面闭合，更顺利获得纠正高血糖、消退炎症和促进血管化，主动塑造促再生表型。

图2. GCP-V-MBG水凝胶对糖尿病创面的体内研究。a) 水凝胶动物实验时间线示意图。b) 不同时间糖尿病创面的代表性照片及示意图。c) 创面闭合率的定量分析（n=5）。d) 第3、6、12天不同水凝胶组创面区域的H&E染色及第12天Masson三色染色（n=4）。e、g) 第6天各组TNF-α、IL-10免疫组化（IHC）染色的代表性图像。f、h) 第6天各组TNF-α、IL-10 IHC染色的定量分析（n=9，随机选取显微图像）。i) 第4天各组CD206、iNOS免疫荧光（IF）染色的代表性图像。j、k) 第4天各组CD206、iNOS IF染色的定量分析（n=6，随机选取显微图像）。

（3）V-MBG体外调控巨噬细胞极化

鉴于V-MBG在体内的关键作用，团队进一步在体外探索其对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）极化的影响。ICP分析证实V-MBG浸提液中含V（8.0±0.9 mg/L）、Si（58.0±0.7 mg/L）、Ca（55.6±4.4 mg/L）和P（36.3±0.2 mg/L）离子，其中Si、Ca、P浓度与MBG组相当，而V离子为V-MBG组独有，提示V离子在调控巨噬细胞行为中起关键作用。CCK-8和活/死染色证实各稀释度下均无显著细胞毒性（存活率>90%）。在LPS诱导的M1型BMDMs中，1/200稀释度的V-MBG浸提液显著抑制M1标志物（CD86、iNOS），上调M2标志物CD163。RT-qPCR显示LPS+V-MBG组M1相关基因（Il-1β、Il-6、Cd80）显著下调，M2相关基因（Cd206、Arg1、Tgf-β）显著上调；蛋白水平验证结果一致。流式细胞术和免疫荧光进一步证实：V-MBG减少CD86⁺/CD206⁻ M1巨噬细胞群，增加CD206⁺/CD86⁻ M2巨噬细胞群（P<0.01），效果与IL-4类似。形态学上，V-MBG处理的BMDMs呈现M2巨噬细胞典型的 elongated 梭形。以上结果证实V-MBG可强效驱动巨噬细胞向M2表型极化。

图3. V-MBG体外调控巨噬细胞极化。a) V-MBG/MBG浸提液制备示意图及浸提液中V、Si、Ca、P离子浓度。b) 不同稀释度V-MBG浸提液的细胞活力。c) 24 h后各组BMDM中Il-1β、Il-6、Cd80、Cd206、Arg1和Tgf-β基因的相对表达（n=4）。d) 24 h后各组BMDM中CD86、iNOS、CD163、CD206和Arg1的蛋白表达（n=3）。e–h) 24 h后各组BMDM的CD86和CD206流式细胞术分析及CD86⁺和CD206⁺细胞的定量分析（n=3）。i) 24 h后各组iNOS、Arg1 IF染色的代表性图像。j、k) 第4天各组iNOS、Arg1 IF染色的定量分析（n=6，随机选取显微图像）。

（4）V-MBG提高BMDM线粒体OXPHOS水平

为阐明V-MBG诱导巨噬细胞极化的分子机制，团队对LPS单独刺激（对照）和LPS+V-MBG浸提液（V-M）处理的BMDMs进行了RNA测序。主成分分析和聚类显示两组间转录组谱明显不同，共鉴定出3790个差异表达基因（DEGs），其中V-M组1990个上调、1800个下调；M2标志物（Arg1、Chil3、Mrc1、Cd163）上调，M1相关基因（Il-1β、Il-6、Nos2、Tnf、Cd86）下调。GO富集提示DEGs与"代谢过程"和"免疫系统过程"显著相关；KEGG分析突出显示"氧化磷酸化"、"糖酵解/糖异生"和"TCA循环"等碳水化合物与能量代谢通路；GSEA证实这些能量通路显著激活。Seahorse分析显示，V-MBG显著提高氧消耗率（OCR），基础呼吸、最大呼吸和ATP生成均显著增加，线粒体呼吸明显增强；胞外酸化率（ECAR）仅轻微升高，糖酵解能力无明显变化。ATP检测显示V-MBG组总ATP生成显著高于LPS组，主要由OXPHOS来源ATP驱动，糖酵解来源ATP略有下降；ATP速率指数和能量图谱证实代谢向OXPHOS主导转变。TEM分析进一步支持上述发现：V-MBG处理增强线粒体大小、融合和膜表面积，线粒体纵横比和面积显著增加，为OXPHOS上调给予了结构证据。这些结果共同表明，V-MBG顺利获得将巨噬细胞代谢重编程向OXPHOS，促进M2极化。

图4. V-MBG提高BMDM线粒体OXPHOS水平。a) 上调DEGs（V-M vs Ctrl）显著富集的GO生物学过程注释分析（n=4）。b) 上调DEGs（V-M vs Ctrl）显著富集的前20条KEGG代谢通路（n=4）。c–e) V-M vs Ctrl的氧化磷酸化（c）、柠檬酸循环（d）和糖酵解（e）通路的GSEA分析。f) LPS、LPS+V-MBG和LPS+IL-4组BMDM的氧消耗率（OCR）-时间曲线（n=6）。g) 各组BMDM的线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP生成（n=6）。h) 各组BMDM的胞外酸化率（ECAR）-时间曲线（n=6）。i) 各组BMDM的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。j) 各组BMDM的ATP生成速率（n=6）。k) 各组BMDM的ATP速率指数（mitoATP生成速率/glycoATP生成速率）（n=6）。l) mitoATP和glycoATP生成速率的平均值±SD（能量图谱）。m) LPS和LPS+V-MBG触发的BMDM线粒体形态。n、o) LPS和LPS-V-MBG组BMDM的线粒体纵横比（n）和线粒体面积（o）（n=20）。

（5）葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS驱动V-MBG诱导的巨噬细胞极化

为探究V-MBG诱导极化过程中OXPHOS增强的代谢机制，团队分析了V-MBG浸提液处理的LPS刺激BMDMs的中心碳代谢。多变量分析显示LPS+V-MBG与LPS组之间代谢明显分离，共鉴定出43种差异代谢物（P<0.05，FC>1），包括糖酵解和TCA循环的关键中间产物（如G6P、F6P、柠檬酸、衣康酸、琥珀酸）。KEGG富集证实最受影响的通路为糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径和TCA循环。代谢物谱显示V-MBG组G6P和F6P水平显著升高，柠檬酸积累增加，而衣康酸、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸减少，提示TCA通量重排；细胞内葡萄糖含量下降，且时间分辨测定显示BMDMs和RAW264.7细胞的葡萄糖摄取和消耗均增加。使用UK5099阻断线粒体丙酮酸输入后，LPS+V-MBG刺激BMDMs的基础呼吸、最大呼吸和ATP生成急剧下降，OXPHOS来源ATP生成显著减少；同时V-MBG上调的M2相关基因（Arg1、Chil3、Mrc1、Retnla）和蛋白（CD163、Arg1）被显著抑制，证明葡萄糖驱动的OXPHOS是V-MBG诱导M2极化的必要条件。此外，脂肪酸氧化（CPT1B和L-肉碱水平降低）和谷氨酰胺代谢（α-KG/琥珀酸比值不变）通路被系统评估排除为主导能量来源；抑制这两条通路仅导致线粒体呼吸轻度下降，但同时引起糖酵解来源ATP的代偿性升高。综上，V-MBG顺利获得增强葡萄糖摄取和代谢，主要顺利获得葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS驱动巨噬细胞M2极化，糖酵解在营养受限条件下作为备用。

图5. 葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS驱动V-MBG诱导的巨噬细胞极化。a) LPS和LPS-V-MBG组间代谢组数据的PCA图。b) LPS-V-MBG vs LPS的火山图。c) 差异代谢物（LPS-V-MBG vs LPS）显著富集的前20条KEGG通路（n=3）。d) LPS-V-MBG vs LPS组糖酵解和Krebs循环相关差异代谢物的定量（n=3）。e) 检测高糖培养基中巨噬细胞葡萄糖消耗的示意图。f、g) LPS-V-MBG和LPS处理的BMDM和Raw264.7细胞的葡萄糖消耗。h) LPS、LPS+V-M和LPS+V-M+UK5099组BMDM的OCR-时间曲线（n=6）。i) 各组BMDM的线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP生成（n=6）。j) 各组BMDM的ATP生成速率（n=6）。k) 各组基因水平Arg1、Chil3、Mrc1、Retnla的相对归一化表达（n=4）。l) LPS、LPS+V-M和LPS+V-M+UK5099组BMDM中CD163、Arg1的蛋白表达（n=3）。m) V-M降低线粒体OXPHOS从而抑制巨噬细胞M2极化的示意图。n) ETO和BPTES功能的示意图。o) LPS、LPS+V-M、LPS+V-M+ETO、LPS+V-M+BPTES和LPS+V-M+ETO+BPTES组BMDM的OCR-时间曲线（n=6）。p) 各组BMDM线粒体OXPHOS来源ATP生成速率（n=6）。q) 各组BMDM线粒体总ATP生成速率（n=8）。  

（6）葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS驱动巨噬细胞极化的机制研究

为阐明V-MBG诱导巨噬细胞极化及OXPHOS增强的信号机制，上调DEGs的KEGG富集分析显示PI3K-AKT、JAK-STAT和TGF-β信号通路显著激活，其中仅PI3K和AKT磷酸化在V-MBG组显著增加，而STAT6活化不变，表明PI3K-AKT（而非JAK-STAT）是该过程中的主要介质。鉴于葡萄糖摄取由胰岛素和IGF-1信号顺利获得INSR-PI3K-AKT轴介导并经GLUT4和GLUT1等葡萄糖转运体促进，团队发现V-MBG上调Insr基因表达并显著升高INSR蛋白水平，同时显著增强GLUT4表达而GLUT1不变，提示GLUT4是主要转运体；使用Fasentin抑制GLUT4后GLUT1发生代偿性膜转位，进一步证实GLUT4是V-MBG诱导葡萄糖摄取的首选途径。LPS处理的巨噬细胞存在TCA通量受损，RNA-Seq数据显示关键TCA酶（特别是IDH3A和SDHA）上调，IDH3A增强表达有助于恢复线粒体功能；PI3K抑制（LY294002）降低IDH3A表达而不影响SDHA，证实V-MBG激活的PI3K信号顺利获得上调IDH3A增强TCA通量。此外，V-MBG显著升高细胞内Ac-CoA水平，并增加ATP-柠檬酸裂解酶（p-ACLY）磷酸化；在关键组蛋白乙酰化标记（H3K9ac、H3K27ac、H3K18ac）中，H3K9ac显著上调，表明柠檬酸-Ac-CoA通量顺利获得特定的H3K9ac介导的表观遗传轴促进M2极化。

图6. 葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS驱动巨噬细胞极化的机制研究。a) 上调DEGs（V-M vs Ctrl）显著富集的前20条KEGG通路（n=4）。b) V-M vs Ctrl的PI3K-AKT信号通路GSEA分析。c) 24 h后各组BMDM中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达（n=3）。d) 24 h后各组BMDM中INSR、GLUT4的蛋白表达（n=3）。e) 24 h后各组INSR、GLUT4 IF染色的代表性图像。f) 各组INSR、GLUT4 IF染色的定量分析（INSR，每组n=5；GLUT4，每组n=7，随机选取显微图像）。g) LPS-V-M vs LPS的糖酵解和TCA循环代谢酶基因表达。h) 24 h后LPS和LPS+V-MBG组BMDM中IDH3A、SDHA的蛋白表达（n=3）。i) 24 h后各组IDH3A、SDHA蛋白相对表达的定量分析（n=3）。j) LPS和LPS+V-MBG组BMDM中乙酰辅酶A的浓度（n=6）。k) 2、4 h后各组BMDM中p-ACLY和ACLY的蛋白表达（n=3）。l) 2、4 h后各组p-ACLY/ACLY蛋白相对表达（归一化至GAPDH）的定量分析（n=3）。m) 各组BMDM中H3K9ac、H3K27ac、H3K18ac的蛋白表达（n=3）。n) LPS和LPS+V-MBG组H3K9ac蛋白相对表达（归一化至Histone H3）的定量分析（n=3）。o) 柠檬酸-Ac-CoA通量顺利获得特定H3K9ac介导的表观遗传轴支持M2极化的过程示意图。

（7）INSR-PI3K信号轴介导葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS

基于上述发现，团队假设V-MBG顺利获得激活INSR-PI3K-AKT通路增强葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS。使用INSR抑制剂AGL-2263（AGL）后，OCR呈剂量依赖性下降，线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP生成显著降低；总ATP生成显著减少，OXPHOS和糖酵解来源ATP均显著下降，证实INSR介导OXPHOS增强。RT-qPCR显示V-MBG上调的M2标志物（Arg1、Chil3、Mrc1）被AGL显著抑制，CD163和Arg1蛋白水平下降，支持INSR在V-MBG诱导M2极化中的作用。ECAR分析显示INSR抑制轻度降低糖酵解，高剂量时糖酵解储备几乎消失，提示INSR抑制损害糖酵解并可能导致OXPHOS下降。PI3K抑制剂LY294002（LY）同样呈剂量依赖性降低OCR、基础呼吸、最大呼吸和ATP生成；总ATP生成下降主要由糖酵解来源ATP显著降低驱动，而OXPHOS来源ATP不变；V-MBG诱导的M2标志物上调被LY剂量依赖性逆转，Arg1蛋白表达降低，凸显PI3K-AKT信号对巨噬细胞M2极化的关键作用。使用GLUT4特异性抑制剂Fasentin证实，GLUT4抑制显著降低OCR、基础呼吸、最大呼吸和ATP生成，并逆转V-MBG诱导的M2标志物上调，确立GLUT4介导的葡萄糖摄取作为M2极化所必需线粒体OXPHOS的关键驱动因素。综上，V-MBG释放的钒离子激活INSR，触发PI3K-AKT轴促进GLUT4介导的葡萄糖摄取，并顺利获得增加IDH3A表达增强代谢通量，协同升高线粒体OXPHOS，驱动巨噬细胞向M2表型极化。

图7. INSR-PI3K信号轴介导葡萄糖驱动的线粒体OXPHOS。a) LPS、LPS+V-M、LPS+V-M+AGL-10和LPS+V-M+AGL-20组BMDM的OCR-时间曲线（n=6）。b) 各组BMDM的线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP生成（n=6）。c) 各组BMDM的ATP生成速率（n=8）。d) 各组基因水平Arg1、Chil3、Mrc1的相对归一化表达（n=4）。e) 各组BMDM中CD163、Arg1的蛋白表达（n=3）。f) 各组BMDM的ECAR-时间曲线（n=6）。g) 各组的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。h) LPS、LPS+V-M、LPS+V-M+LY-20和LPS+V-M+LY-40组BMDM的OCR-时间曲线（n=6）。i) 相应组BMDM的线粒体基础呼吸、最大呼吸和ATP生成（n=6）。j) 相应组BMDM的ATP生成速率（n=8）。k) 使用PI3K抑制剂（LY294002）后各组BMDM中Arg1、Chil3、Mrc1的相对基因表达（n=4）。l) 示意图：INSR-PI3K信号通路介导葡萄糖来源OXPHOS的改善及随后巨噬细胞向M2表型极化。