K8·凯发(中国)

图1. 自限制样压电-芬顿样微球介导超声可调线粒体膜电位调控的示意图。a) 基于IDD患者髓核样本的单细胞转录组分析表明，MMP受损导致的自噬抑制是IDD发生和进展的关键致病机制。b) PF@MS制备示意图：铁掺杂BTO纳米颗粒（Fe-BTO@NPs）和苯硼酸功能化脂质（LFB@NPs）分别顺利获得水热法和成膜法制备；M@MS和PF@MS分别顺利获得微流控技术和点击化学制备。c) PF@MS局部椎间盘内注射及修复机制：释放的LFB@NPs经硼酸酯/唾液酸辅助的网格蛋白介导内吞进入细胞（对ATP耗竭具有部分耐受性），并可能经溶酶体逃逸进入胞质；Fe-BTO@NPs诱导具有自限制样反应性的压电-芬顿样活性，上调受损MMP并激活PINK1-Parkin-LC3-II信号通路，进而激活线粒体自噬，高效清除受损线粒体，抑制NF-κB介导的炎症与胶原降解信号轴，促进胶原沉积与IDD修复。

(2)单细胞转录组学与多层级验证鉴定线粒体自噬障碍为IDD的中心致病枢纽

对椎间盘退变（IDD）患者及健康对照的髓核组织进行单细胞RNA测序，发现IDD样本中软骨细胞显著耗竭。差异基因分析显示氧化磷酸化、NADH脱氢酶活性等线粒体功能相关基因显著下调，炎症相关通路上调。线性回归分析表明炎症/降解水平与线粒体自噬评分显著负相关（Pearson r = −0.80，R² = 0.64，p < 0.001；β = −0.75，p < 0.001）。GSEA显示IDD中合成代谢通路（如COL2）受抑，线粒体应激（HSPD1）与NF-κB信号通路激活。

人（Pfirrmann II/IV级）与大鼠（健康/IDD）组织的多层级验证显示：随退变加深，组织由合成代谢向分解代谢转变，II型胶原减少、MMP13增加；退变样本中Parkin与LC3-II共定位显著丢失；JC-1染色显示线粒体膜电位广泛丧失，透射电镜证实退变细胞内肿胀线粒体累积而线粒体自噬小体稀缺。将膜电位恢复水平与线粒体自噬再激活及凋亡起始相关联，确定最优治疗窗口：JC-1比值1.4～1.6可在最小化凋亡的同时最大化Parkin募集。

图2. 单细胞转录组学与多层级验证鉴定线粒体自噬障碍为IDD的中心致病枢纽。a) 实验设计示意图。b) 健康人（H，3名供者）与IDD患者（I，4名供者）NP细胞的UMAP图。c) H组和I组细胞类型比例，显示IDD中软骨细胞耗竭。d、e) IDD软骨细胞差异基因的功能注释（GO和KEGG），揭示线粒体功能通路（如NADH脱氢酶活性）下调和炎症通路上调。f) 线性回归分析显示炎症/ECM降解模块评分与线粒体自噬/线粒体功能模块评分显著负相关（R² = 0.64，p < 0.001）。g) GSEA图显示IDD中线粒体应激（HSPD1）、NF-κB信号（RELA）富集及II型胶原（COL2）通路受抑。h) 人（II/IV级）和大鼠（健康/IDD）组织验证，包括T2加权MRI、HE、番红O染色及COL2、MMP13、Parkin、LC3-II的免疫组化/免疫荧光检测。i) 图H中COL2、MMP13、PARKN和LC3-II阳性细胞的定量。j) NP细胞中Parkin与LC3-II信号沿横断面线的荧光强度分布。k) 大鼠NP组织的蛋白质印迹分析。l) 线粒体健康评估：JC-1染色显示MMP丧失（红转绿），TEM显示正常（Nor-mitos）、异常/肿胀（Ab-mitos）线粒体及线粒体自噬小体（Mito-AVs）结构。m) 人与大鼠组织中MMP丧失（JC-1红/绿比）的定量。n) MMP水平（JC-1聚集/单体比值）与线粒体自噬激活（Parkin募集）及凋亡诱导（Caspase-3活性）的相关性分析，用于确定治疗窗口。

(3) 核心-壳层纳米体系及其水凝胶微球载体的设计与表征

构建基于自限制样压电-芬顿样纳米复合物的多级递送系统，包含三个步骤：压电核心合成、功能化脂质壳层包覆及响应性水凝胶微球封装。

水热法合成Fe-BTO压电核心，TEM显示其四方晶结构，平均粒径约180 nm；压电力显微镜测得压电系数d₃₃为11.0 pm·V⁻¹，局部界面势1.6～3.3 mV，足以促进Fe³⁺/Fe²⁺相互转化。XPS显示超声刺激后Fe 2p₃/₂峰由712.3 eV移至710.8 eV，证实部分Fe³⁺还原为Fe²⁺。ICP-MS显示超声后上清液铁浓度仅由约2 μg·L⁻¹升至9 μg·L⁻¹，远低于均相芬顿反应所需浓度，且上清液几乎无ROS生成活性，证实催化活性源于颗粒表面压电-芬顿样过程而非浸出的铁离子。

经成膜法以苯硼酸功能化脂质壳层包覆形成LFB@NPs，TEM证实均匀核-壳结构，水动力学直径约120 nm；DLS显示48 h内保持稳定，而裸Fe-BTO@NPs显著聚集。经微流控将LFB@NPs封装于GelMA微球形成PF@MS，SEM显示平均直径197±12 μm，XRD与EDS确认BTO晶峰及LFB@NPs在水凝胶基质中的存在。

图3. 核心-壳层纳米体系及其水凝胶微球载体的设计与表征。a) 核壳压电-芬顿纳米复合物（LFB@NP）合成示意图，由脂质壳层和铁掺杂钛酸钡（Fe-BTO）核心组成。b、c) 透射电镜（TEM）图像：b) 裸Fe-BTO核心（约180 nm，插图为四方晶格），c) 最终核壳LFB@NP（约200 nm）。d、e) 单个LFB@NP的EDS元素分布图及相应能谱，显示Ba、Ti、Fe（核心）和P（壳层）元素的分布。f–i) 压电力显微镜（PFM）分析：f) LFB@NP形貌，g) 裸Fe-BTO核心的压电系数（d₃₃）图，h) LFB@NP的振幅-电压"蝴蝶"曲线，i) 相位-电压磁滞回线。j) 动态光散射（DLS）分析Fe-BTO和LFB@NPs在PBS中48 h的水动力学直径。k) PF@MS制备示意图：LFB@NPs顺利获得单宁酸（TA）介导的动态键负载到GelMA微球（M@MS）中。l) 空白M@MS和负载LFB@NP的PF@MS的扫描电镜（SEM）图像（比例尺：概览30 μm，表面细节1 μm）。m) M@MS和PF@MS的X射线衍射（XRD）图谱。n) PF@MS的EDS能谱。o) 光学显微镜取得的M@MS和PF@MS粒径分布。

(4) PF@MS的细胞内分布、响应性功能与自限制样特性

PF@MS微球解体后释放的LFB@NPs被细胞内吞并转运至线粒体，与Tom 20高度共定位；流式细胞术显示JC-1聚集体比例：空白组80.3±1.91%，模型组14.2±1.45%，PF@MS组恢复至54.3±2.40%。

摄取机制分析表明：摄取以能量依赖的内吞为主，网格蛋白介导途径为主导；过量游离唾液酸显著降低细胞结合，证实硼酸酯-唾液酸相互作用的关键作用。与未修饰Fe-BTO@NPs相比，LFB@NPs在ATP耗竭下仅轻度摄取降低，赋予系统部分ATP耗竭耐受性，有利于能量匮乏的退变微环境中的货物内化。

微球在模拟退变微环境（pH 6.5，含MMP13/透明质酸酶）中25天内逐渐崩解，证实病理条件下的响应性降解能力。Fe-BTO使溶液pH上升后迅速稳定，反应自主终止，而游离FeCl₃诱导持续pH升高，体现自限制样反应的安全特征。H₂O₂中纳米颗粒累积释放显著加速，超声进一步放大：24 h内超声触发组释放14.5%负载纳米颗粒，达7.25 μg·mL⁻¹有效浓度；PF@MS在H₂O₂中降解显著快于PBS。活/死染色和CCK-8显示M@MS与PF@MS组细胞存活率与对照组无显著差异，超声联合处理不损害细胞活力。

图4. 系统的细胞内化、响应性释放及自限制样特性。a) 细胞摄取与胞内作用示意图。b) NP细胞中Dio-LFB@NPs（绿色）与线粒体、溶酶体和内质网（红色）的共定位（比例尺10 μm）。c) 沿图B中箭头方向的荧光强度分布。d、e) 经寡霉素（ATP抑制剂）预处理后NP细胞与Dio标记LFB@NPs（封装于PF@MS中）孵育的流式细胞术分析及平均荧光强度定量。f) PF@MS在酸性PBS（pH 6.5，含MMP-13/透明质酸酶）中25天的形态学降解（比例尺100 μm）。g) 显示Fe-BTO芬顿样反应耗H⁺、自限制样性质的pH变化曲线。h) 超声触发的PF@MS纳米颗粒释放。i) PF@MS在PBS与H₂O₂中的质量损失。

(5) PF@MS以自限制样方式恢复线粒体稳态与细胞能量代谢

采用叔丁基过氧化氢（TBHP）建立线粒体损伤模型。JC-1探针显示TBHP使红/绿荧光比值降至对照的约0.5，超声激活后PF@MS将其恢复至1.3，实现部分且受控的膜电位恢复而非完全超极化。TMRM动态追踪显示PF@MS（US）在30 min内升高膜电位并维持120 min稳定平台期，测试剂量和超声窗口内未观察到异常超极化，证实其自限制样反应性。

膜电位恢复触发经典线粒体自噬通路。RT-qPCR显示PF@MS（US）显著上调Prkn2和Map1lc3b mRNA，分别升高约4.8倍和3.5倍；PRKN-LC3-II及LC3-II-Tom 20共定位分析证实线粒体向自噬体的靶向增强。巴弗洛霉素A1阻断实验显示LC3强度升高、p62水平降低，BafA1处理后p62降解被阻断，证实自噬通量增强而非降解受损。TEM显示处理后肿胀线粒体减少、线粒体自噬小体数量增加、健康线粒体比例上升。功能层面，PF@MS恢复细胞ATP/ADP比值并挽救受损的氧消耗率；DCFH-DA染色显示超声下过量ROS被清除至接近对照水平。五倍过量处理对照组进一步验证其安全特性。

图5. PF@MS以自限制样方式调控线粒体膜电位（MMP），恢复线粒体稳态与细胞能量代谢并促进选择性线粒体自噬。a) 机制示意图：MMP崩塌的受损线粒体无法启动有效线粒体自噬，PF@MS将MMP部分恢复至功能阈值，激活PINK1-Parkin信号通路选择性清除受损线粒体，从而改善细胞生物能量代谢。b–d) MMP的代表性荧光图像b)、JC-1聚集/单体（红/绿）比值定量c)和流式细胞术分析d)。e) Parkin（绿色）与自噬体标志物LC3-II（红色）的免疫荧光染色。f、g) Park2和Map1lc3b（Lc3b）的相对mRNA表达水平。h) 不同处理下NP细胞中DAPI、TOM和LC3-II的免疫荧光染色。i) LC3-TOM共定位指数定量。j、k) 线粒体形态和自噬体数量的TEM代表性图像j)与定量分析k)。l) 细胞ATP/ADP比值。m) Seahorse分析氧消耗率（OCR），显示线粒体呼吸功能的恢复。

(6) PF@MS治疗使NP细胞转录组重编程为促合成、抗分解状态

对TBHP损伤的大鼠NP细胞进行全转录组RNA测序，比较M@MS对照组与PF@MS（US）治疗组。PCA图显示两组清晰分离，表明超声激活的PF@MS诱导系统性的转录重编程。火山图分析显示Mmp13、Mmp12、Mmp3显著下调，Col2a1上调。GO/KEGG富集分析显示前三位显著富集通路为：线粒体自噬（校正p = 3.2×10⁻¹²，富集分数 = 42）、胶原生物合成（校正p = 3.2×10⁻¹¹，富集分数 = 38）及自噬（校正p = 3.2×10⁻⁹，富集分数 = 30）。GSEA显示炎症反应等分解代谢通路显著下调，ECM组织与线粒体自噬相关通路上调；弦图揭示炎症基因、趋化因子与ECM重塑基因间的互联调控。

蛋白和基因表达验证与转录组数据一致：免疫荧光显示MMP13蛋白显著减少、COL2沉积显著增加；RT-qPCR证实MMP13显著下调、COL2A1显著上调；Mmp10、Adamts4等关键分解代谢酶亦被抑制，聚集蛋白聚糖Agrn上调，表明组织转向ECM合成而非降解。

图6. 联合超声刺激的PF@MS将退变大鼠NP细胞转录组重编程为促合成表型。对处理后的NP细胞进行全转录组RNA测序（实验示意图见K）。a) 转录组数据的主成分分析（PCA）显示两组清晰分离。b) 火山图突出差异表达基因（DEGs），治疗组中合成代谢基因显著上调、分解代谢基因显著下调（|log2FC| > 1，p < 0.05）。c) 弦图进一步阐释关键分解代谢酶MMP-13与其相关信号通路之间的复杂关系。d) 这些DEG的GO和KEGG分析揭示其与巨噬细胞功能和胶原代谢相关通路的富集。e) 基因集富集分析（GSEA）确认炎症和MMP-13相关通路显著下调，COL2A1合成和线粒体自噬通路上调。f、g) 免疫荧光染色显示处理后细胞中MMP13（红色）减少、COL2A1（绿色）增加，平均荧光强度定量见I。h) RT-qPCR验证Mmp13受抑和Col2a1诱导，j) 同时验证其他分解基因（Mmp10、Adamts4）下调及关键蛋白聚糖Agrn上调（比例尺20 μm）。

(7)PF@MS在大鼠IDD模型中的体内疗效

顺利获得针刺建立大鼠尾椎IDD模型，采用局部注射微球后经皮超声激活的治疗方案，于干预后4周和8周顺利获得影像学和组织学评估疗效。T2加权MRI显示8周时PF@MS（US）组维持高T2信号强度，接近健康椎间盘；模型组信号显著丢失，表明严重脱水和退变。组织学检查显示：HE染色中治疗组椎间盘结构保存良好，NP与纤维环边界清晰，模型组呈严重结构紊乱、纤维化和NP细胞丢失；番红O-快绿染色显示治疗组蛋白聚糖均匀分布。定量分析显示，PF@MS（US）组8周时椎间盘高度指数维持初始高度的89.2±3.4%，显著优于模型组（52.1±5.2%）及未加超声激活组；组织学评分显著更低，NP水分含量显著更高，多指标聚类分析显示其独特的综合疗效特征。

安全性方面，血清生化指标（ALT、AST、BUN、Cr）、全血细胞计数及铁代谢指标（血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度）与对照组无显著差异，心、肝、脾、肺、肾等主要器官HE染色未见异常，证实良好的体内生物相容性。

图7. PF@MS在大鼠椎间盘退变（IDD）模型中的体内治疗效果。a) 实验设计示意图，包括模型建立、治疗给药（针刺和US）及评估时间线。b) 治疗后8周椎间盘的代表性T2加权MRI扫描。c) 8周时组织学分析：HE染色显示整体椎间盘形态，番红O-快绿染色指示蛋白聚糖（红色）和胶原（绿色）分布。d) 椎间盘高度指数（DHI）百分比定量分析：PF@MS（US）组实现约89%的椎间盘高度恢复（相对于对照组）。e) 基于细胞密度和结构完整性的组织学评分。f) NP中的水分含量。g) 总结各组综合疗效的聚类热图分析：PF@MS（US）组独特的表达特征显示其相对于单一治疗的显著协同疗效。

(8) PF@MS激活体内线粒体自噬与线粒体稳态

为阐明体内治疗效应的分子机制，研究团队顺利获得免疫荧光分析椎间盘组织中关键标志物的共定位与表达。由于固定组织中线粒体膜电位和通量的活体测量难以实现，研究以Parkin/LC3-II共定位作为体内线粒体自噬相关反应的支持性证据。

结果显示，PF@MS（US）组Parkin（绿色，关键E3泛素连接酶）与LC3-II（红色，自噬体标志物）的共定位显著增强：术后4周，免疫荧光图像和定量强度分布显示PF@MS（US）组Parkin与LC3-II信号强重叠，表明自噬体成功募集至受损线粒体；这一线粒体自噬增强趋势在8周时持续存在。平均光密度（AOD）定量分析显示，PF@MS（US）组Parkin表达显著上调且4周、8周持续存在，而单独PF@MS（无超声）组增幅小得多，证实超声激活对该通路的稳健激活至关重要；LC3-II表达在4周和8周均显著升高。线粒体自噬起始因子（Parkin）与自噬体标志物（LC3-II）的同时升高支持治疗触发协调的线粒体质量控制。转录层面，"线粒体自噬-动物"通路的分析显示PINK1和Parkin表达显著上调。

图8. 联合超声刺激的PF@MS促进退变椎间盘组织体内的线粒体稳态。a、c) 治疗后4周a)和8周c)椎间盘组织中Parkin（绿色）与LC3-II（红色）共定位的代表性免疫荧光图像（比例尺60 μm）。b、d) 对应于A和C图像的荧光强度定量分布，展示Parkin与LC3-II信号的空间相关性。e、f) 4周e)和8周f)时Parkin表达的平均光密度（AOD）定量分析。g、h) 4周g)和8周h)时LC3-II表达的AOD定量分析。i) KEGG"线粒体自噬-动物"通路示意图，突出显示转录分析鉴定的关键上调基因（如PINK1、Parkin），其驱动受损线粒体的清除。

(9) PF@MS治疗顺利获得抑制炎症和促进胶原合成在体内重塑基质代谢

在确立PF@MS联合超声恢复线粒体稳态的基础上，研究团队考察了其对细胞外基质（ECM）代谢的下游影响。免疫组化显示，治疗在4周和8周时显著抑制分解代谢酶MMP13并强力促进合成代谢蛋白COL2。定量分析证实联合治疗在渐进恢复组织完整性方面优于单独PF@MS。机制上，该修复由线粒体膜电位调控和PINK1-Parkin-LC3-II轴激活所驱动，顺利获得下调基质降解、上调基质合成促进椎间盘功能性修复。

图9. 联合超声刺激的PF@MS重塑退变椎间盘组织的细胞外基质代谢。a、b) 4周a)和8周b)时椎间盘组织中MMP13的免疫组化染色。c、d) 4周c)和8周d)时COL2的免疫组化染色（比例尺：低倍0.5 mm，高倍50 μm）。e、f) MMP13e)和COL2f)的平均光密度（AOD）定量分析。g) 机制示意图：经由PINK1-Parkin-LC3-II通路恢复功能性线粒体，导致MMP13下调和COL2上调，促进椎间盘修复。