K8·凯发(中国)

图1. HAPP水凝胶的合成与表征。a) HA-PBA的合成示意图及形成HAPP水凝胶网络的硼酸酯交联机制。b) HA和HA-PBA的1H NMR谱，证实PBA成功接枝。c) HA、PBA、HA-PBA和HAPP的FTIR光谱，显示硼酸酯键的特征峰。d) HA、PBA、PVA224、HA-PBA和HAPP的DSC曲线，揭示凝胶形成后的热转变及增强的分子间相互作用。e) 不同PVA224含量HAPP水凝胶的宏观图像和SEM显微照片，显示具有可调孔径的多孔网络。f) 孔径的统计分析（n = 20个独立样本）。g) HAPP水凝胶在37°C PBS中的溶胀行为（n = 3个独立样本）。h) 30%相对湿度下的保湿性能，表明其维持湿润环境的能力（n = 3个独立样本）。i) 频率扫描曲线（0.1–10 Hz，1%应变，37°C），显示水凝胶的黏弹性行为。j) 线性黏弹区（LVR）扫描，显示网络结构在小变形下的稳定性。k) 步进应变扫描（1%和1000%，1 Hz，37°C），显示可逆恢复行为和自愈合能力。l) 剪切变稀曲线，表明HAPP的可注射性。m) 蠕变-恢复测试，证实可逆变形和网络恢复。n) 屈服应力分析，显示水凝胶网络的机械强度和韧性。

（2）HAPPF水凝胶的自愈合、环境响应性H2S/荧光释放及组织粘附与止血性能

HAPPF凭借动态硼酸酯键与协同氢键在室温下30 s内完成自愈，恢复结构完整性（图3a，b）。药物释放实验显示，HSDF-NH2在中性PBS中48 h累积释放约50%，在模拟糖尿病创面条件（pH 6.0、5 mg/mL葡萄糖、100 mM H2O2）下48 h近100%释放（图3c），源于H2O2氧化硼酸酯键及葡萄糖竞争性结合。释放的HSDF-NH2生成H2S并伴随自报告荧光，72 h内荧光强度增强约100倍（图3d），定量产生约40.82 µM H2S（图3e），荧光与H2S生成量高度相关（R² = 0.9951，图3f，g），可作实时监测指标。HAPPF具强H2O2清除能力：含药组4 h清除约52%，高于未载药组的38%，12 h近乎完全清除（图3h）。其粘附源于PBA与组织基团的动态共价/非共价相互作用及PVA氢键（图3i），可拉伸至约9 cm（图3j），并在离体心、肝、脾、肺、肾表面牢固粘附（图3k）。止血实验中60 s内实现止血，断尾失血量降至对照组三分之一，肝脏模型减少约771.25 mg失血（图3l，m）。

图2. HAPPF水凝胶的多功能表征。a) 宏观和显微图像，证明HAPPF水凝胶无缝自愈合及界面裂缝在30 s内消失。b) 动态硼酸酯键和氢键相互作用实现可逆自修复的示意图。c) 不同环境条件下HSDF-NH2的累积释放。d) HAPPF在72 h内随时间变化的荧光发射，证明其内在自报告行为。e) 亚甲基蓝法定量的H2S生成动力学。f) 随时间变化的荧光变化，反映H2S释放。g) 荧光强度与H2S释放之间的相关性。h) HAPPF和HAPP水凝胶的H2O2清除效率。i) 组织粘附示意图，突出显示PBA与羟基、羧基和氨基的相互作用。j) 宏观拉伸试验，显示水凝胶可拉伸至约9 cm。k) 在潮湿离体组织（心、肝、脾、肺、肾）上的粘附。l) 大鼠断尾止血试验，显示60 s内快速止血。m) 肝脏出血模型，证明有效减少失血。

（3）HAPPF水凝胶的生物相容性、促迁移与促血管生成潜能

采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）评估HAPPF与HAPP水凝胶的生物相容性、促迁移作用和促血管生成潜能。溶血试验显示，HAPPF水凝胶的溶血率为1.63%（HAPP为1.58%），远低于5%的安全阈值，表明其红细胞破坏可忽略不计（图4a）。Calcein-AM/PI双染色进一步证实，HUVEC在水凝胶浸提液中培养24–72 h后均保持高细胞活力，未观察到明显细胞毒性（图4b）；在Rosup诱导的氧化应激下，HAPPF组细胞活力显著提高，说明释放的H2S能有效减轻ROS介导的细胞损伤。划痕愈合实验显示，24 h后HAPPF组划痕闭合率达62.82%，显著高于HAPP组（41.60%）、模型组（21.32%）和对照组（25.94%）（图4c，d），表明ROS触发的H2S释放显著促进HUVEC迁移，HA骨架还可能顺利获得CD44介导的相互作用协同增强细胞粘附与运动。Transwell实验进一步证实，与HAPP组和对照组相比，HAPPF浸提液显著增强HUVEC的纵向迁移（图4e，f），提示H2S可能顺利获得激活PI3K/Akt和VEGF信号通路促进细胞趋化与跨膜迁移。成管实验显示，HAPPF处理的HUVEC形成更广泛、相互连通的血管样网络，定量分析证实其血管总长度、节点数和网络面积均显著更高（图4g，h），说明H2S释放有效增强了血管生成活性。

图3. HAPPF水凝胶的生物相容性、迁移和血管生成评估。a) HAPP和HAPPF水凝胶的溶血试验，插图显示与水凝胶共孵育的红细胞。b) HUVEC与水凝胶浸提液培养24、48和72 h后的活/死染色图像（比例尺：200 µm）。c) HUVEC与水凝胶孵育0、12和24 h后的细胞迁移图像（比例尺：200 µm）。d) 不同组在12和24 h迁移区域的定量分析。e) HUVEC与水凝胶孵育12 h后的Transwell染色图像（比例尺：200 µm）。f) 结晶紫染色迁移细胞的定量分析。g) HUVEC与水凝胶孵育6 h后的成管实验（比例尺：100 µm）。h) 总管长度的定量。i,j) 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定不同处理下HUVEC中TNF-α i) 和IL-6 j) 的表达。

（4）HAPPF水凝胶的体外抗炎、抗氧化与H2S释放性能

为全面评估HAPPF水凝胶的体外抗炎、抗氧化与H2S释放性能，该团队第一时间测定了不同刺激下HUVEC中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平。Rosup刺激后三种细胞因子均升高超过10%，表明氧化应激诱导了炎症；HAPP与HAPPF均能显著降低细胞因子分泌，且HAPPF抗炎效果更强，分别使TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低约30.00%、27.39%和24.50%，降幅明显大于HAPP组的17.10%、20.18%和14.50%（图4i，j及图5a），说明高分子量HA本身具有抗炎活性，而HAPPF中HSDF-NH2的ROS响应性H2S释放进一步放大了这一效应。随后系统考察了HAPPF的固有荧光与H2S释放行为：HSDF-NH2被激活后在不同放大倍数（20×和63×）下发出明显的绿色自发荧光信号（AF430），加入H2S特异性探针Cy-NO2后，HAPPF组在高倍镜下观察到强红色荧光，同时伴随激活态HSDF-NH2的AF430特征信号，证实H2S成功生成（图5b）；H2S荧光通道的半定量分析显示HAPPF组荧光强度显著高于HAPP组（图5c）。ROS荧光成像显示模型组ROS信号最高，而HAPPF处理将ROS荧光降至接近正常水平（图5d，e）：定量数据显示HAPP组ROS减少约50%，HAPPF组则实现近乎完全的清除，这一优势源于HAPP中硼酸酯键消耗ROS与HSDF-NH2的ROS触发H2S释放的双重机制。

图4. HAPPF水凝胶的体外抗炎、抗氧化和H2S释放性能。a) ELISA测定不同处理下HUVEC中IL-1β的表达。b) 代表性荧光图像，显示ROS刺激下HSDF-NH2的自荧光和Cy-NO2探针检测到的H2S特异性荧光（63×，比例尺：40 µm）。c) H2S荧光强度的半定量分析。d) 不同组HUVEC细胞内ROS水平的代表性图像（63×，比例尺：40 µm）。e) ROS荧光强度的半定量分析。

（5）HAPPF水凝胶体外调控免疫-血管-神经再生与抗凋亡活性

免疫荧光与ELISA结果显示，Rosup诱导的氧化应激使HUVEC中VEGF、NGF、CGRP与TGF-β表达显著下调，凋亡率升至18.31 ± 2.44%；HAPP组部分恢复（凋亡率9.32 ± 1.06%），HAPPF组上述标志物恢复至近生理水平（VEGF 2514.68 ± 346.45、NGF 99.61 ± 6.65、CGRP 12.58 ± 0.72、TGF-β 451.76 ± 56.04 pg/mL），凋亡率降至8.15 ± 0.82%（图6a–j）。机制上，HSDF-NH2释放的H2S激活PI3K/Akt/eNOS通路，增强VEGF介导的血管生成并维持内皮活性；经MAPK与PPAR通路上调CGRP和NGF，维持神经血管耦合并促进神经再生；H2S上调TGF-β，可能与抑制IL-17及NF-κB信号、缓解炎症级联反应有关。上述协同作用重建神经-血管轴稳态，降低凋亡率并促进细胞存活。

图5. HAPPF水凝胶对HUVEC的体外再生和抗凋亡作用。a,c,e,g) 免疫荧光图像，显示不同处理下HUVEC中VEGF a)、NGF c)、CGRP e) 和TGF-β g) 的表达（20×，比例尺：20 µm）。b,d,f,h) ELISA定量HUVEC培养上清液中VEGF b)、NGF d)、CGRP f) 和TGF-β h) 的分泌水平（n = 6个独立样本）。i,j) 流式细胞术分析及相应不同处理组HUVEC总凋亡率的统计。

（6）HAPPF水凝胶在糖尿病大鼠体内的荧光成像与创面愈合性能

活体成像显示，HAPPF敷于糖尿病大鼠创面后荧光随时间增强：0 h信号微弱，24 h时供体与H2S（CY-NO2检测）的辐射效率分别达6.69 × 10⁹与2.74 × 10⁹；匀浆H2S浓度24 h达峰值4.32 nmol/mg，与荧光信号高度相关，实现H2S体内实时可视化（图7b，c）。疗效在糖尿病SD大鼠10 mm全层切除创面模型上评估（图7a）：第3天HAPPF组创面缩小率69.73 ± 5.32%，为模型组（18.43 ± 2.12%）的3.78倍、3M组的1.7倍（图7d）；第14天缩小率达97.75 ± 0.48%，高于模型组与3M组（图7e）。H&E与Masson染色显示，第7天HAPPF组胶原体积分数约47.99%（p < 0.001），第14天再上皮化率近100%（p < 0.0001）并出现成熟皮肤附属器（图7f，g）。结果表明HAPPF可调控炎症、促进血管生成与胶原重塑，加速糖尿病创面愈合。

图6. HAPPF水凝胶在糖尿病大鼠体内的评估。a) 创面愈合研究实验时间线示意图。b) 代表性活体荧光图像，显示24 h内创面部位ROS触发的HSDF-NH2释放（绿色）和H2S特异性探针CY-NO2响应（红色）（n = 3个独立样本）。c) HSDF-NH2和CY-NO2荧光强度的定量分析，并与创面皮肤匀浆中实测H2S浓度相结合（n = 6个独立样本）。d) 不同处理下从第0天到第14天创面愈合过程的代表性照片（比例尺：1 cm）。e) 在第3、7、11和14天测量的创面收缩率（n = 6个独立样本）。f) 第7天和第14天采集的创面组织的代表性H&E染色图像（黑框表示肉芽组织；蓝色箭头表示红细胞和出血区域；红色箭头表示嗜酸性粒细胞和中性粒细胞；黄色星号表示新生毛细血管；绿色箭头表示新沉积的胶原纤维；橙色箭头表示皮脂腺和毛囊等皮肤附属器）。g) 第7天和第14天采集的创面组织的代表性Masson三色染色图像。

（7）体内创面愈合的系统组织病理学与免疫荧光分析

ROS染色显示，第14天HAPPF组创面ROS水平较模型组下降约30%（p < 0.001）、较HAPP组下降21.19%（图8b，h）；免疫荧光显示其抑制M1极化（CD86降至模型组10%）并促进M2极化（CD206升高62.5倍，均p < 0.001），M2/M1比值显著升高（图8c，i）。血管神经再生方面，HAPPF组VEGF表达第7、14天分别较模型组升高2.52倍与3.26倍（图8d，j），CGRP与NGF分别升至42.90与65.02 pg/mL（图8e，k），印证H2S桥接神经与血管再生的调控机制。时序分析显示，第7天TGF-β为模型组2.82倍，第14天回落至基线，TNF-α降至31.78 ng/L（较模型组降低70.56%），呈早期促再生、晚期抗纤维化的双相调控（图8f，g，l）。生物相容性评价显示HAPPF渐进式可控降解，植入界面无慢性炎症，血液学与主要脏器指标均正常。

图7. 体内创面愈合的系统组织病理学和免疫荧光分析。a) 示意图，说明H2S协调的分层级联愈合过程，包括糖尿病创面治疗中的抗氧化防御、免疫再平衡、血管生成、神经再生和瘢痕抑制。b) 第7天和第14天创面组织中ROS（红色）的代表性免疫荧光图像，绿色荧光表示HSDF-NH2响应（比例尺：200 µm）。c) 第14天创面切片中CD86（红色）和CD206（绿色）的免疫荧光共染色（比例尺：200 µm）。d) 第7天和第14天皮肤组织中VEGF的免疫荧光染色（比例尺：200 µm）。e) 第14天创面组织中CGRP（绿色）和NGF（红色）的免疫荧光染色（比例尺：200 µm）。f) 第14天皮肤组织中TNF-α的免疫组化染色（比例尺：200 µm）。g) 第14天皮肤组织中TGF-β的免疫组化染色（比例尺：200 µm）。h–l) 相应时间点ROS h)、CD86和CD206 i)、VEGF j)、CGRP和NGF k) 以及TNF-α。 l) 相对表达水平的定量分析。

（8）创面组织的转录组学分析

PCA显示各组转录组明显分离。差异分析显示，与模型组相比HAPPF共鉴定出538个DEGs（304上调、234下调）；HAPPF与HAPP直接比较鉴定出181个显著上调基因，包括Mybpc2、Pygm和Adipoq（图9a，b）。GO/GSEA与KEGG分析将PPAR、IL-17、NF-κB、TGF-β及代谢通路鉴定为中枢枢纽，HAPPF在PPAR通路的富集程度远高于HAPP（图9c–e）。ELISA证实，HAPPF将PPARγ提升至311.81 ± 12.55 pg/mL（较模型组升高1.37倍），IL-17A与iNOS分别降低4.42倍与2.7倍，BDNF较HAPP组上调2.51倍（39.55 ± 7.96 pg/mL）。综上，H2S经PPARγ/NF-κB/BDNF轴微调TGF-β信号，在抑制慢性炎症、调节脂质代谢与避免胶原过度沉积中起中枢作用，促进创面愈合并抑制瘢痕形成。

图8. 创面组织的转录组学分析（bulk RNA测序）。a) 第14天与创面愈合过程相关的差异表达基因热图，包括角化、血管生成、神经再生、免疫反应和ECM重塑。b) HAPP和HAPPF水凝胶处理组与模型组相比的生物过程GO富集分析。HAPPF处理显著上调与神经元调节、角化、血管生成和ECM重建相关的基因集。c–e) GSEA显示HAPPF处理对PPAR c)、IL-17 d) 和NF-κB e) 信号通路的显著调控。f) HAPPF水凝胶处理组与HAPP水凝胶处理组相比富集的生物过程。g) HAPPF水凝胶处理组与模型组相比富集的生物过程（n = 3个独立样本）。

（9）HAPPF水凝胶顺利获得抗纤维化信号调控缓解糖尿病兔耳增生性瘢痕

糖尿病兔耳创面模型经四氧嘧啶诱导（血糖 > 14 mmol/L）并制备15 mm全层缺损建立（图10a）。第16天HAPPF组创面近完全上皮化，第30天模型组形成增生性瘢痕，而HAPPF组创面平整、色素均匀（图10b）。定量显示，模型组瘢痕面积约314 mm²（约为原创面的50%），HAPPF组瘢痕面积减少约73%（p < 0.001）；温哥华瘢痕量表（VSS）评分0.95 ± 0.08，显著低于模型组（2.50 ± 0.36）与HAPP组（1.22 ± 0.25）（图10m）。组织学与天狼星红染色显示HAPPF组胶原纤维平行有序、COL I/COL III分布协调，瘢痕隆起指数下降约54%，总胶原沉积减少约58%（图10c–e，j）。机制上，HAPPF使活性TGF-β降低约59.17%，p-Smad2与p-Smad3分别下降71.87%与76.57%，α-SMA抑制约75.96%（p < 0.001，图10f–i，k，l，n）。结果表明H2S顺利获得阻断TGF-β/SMAD2/3信号轴抑制成纤维细胞过度激活与细胞外基质无序沉积，减轻纤维化并促进功能性再生。

图9. HAPP和HAPPF水凝胶在糖尿病兔耳增生性瘢痕（HS）模型中的体内评估。a) 糖尿病兔耳模型中H2S介导的HS修复治疗过程示意图。b) 不同时间点（0–30天）创面愈合和瘢痕形成的代表性照片。c–e) 不同处理组瘢痕组织的代表性染色图像：(c) H&E、(d) Masson三色染色、(e) 天狼星红染色（偏振光下观察），用于评估胶原组织和排列（比例尺：200 µm）。f–i) 第30天瘢痕组织中关键标志物的免疫组化染色，包括(f) α-SMA、(g) TGF-β、(h) p-Smad2和(i) p-Smad3（f–g比例尺：200 µm；h–i比例尺：100 µm）。j) 瘢痕隆起指数（SEI）的定量分析。k,l) 瘢痕组织中α-SMA k) 和TGF-β l) 表达水平的定量（n = 6个独立样本，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，单因素方差分析加Tukey事后检验）。m) 温哥华瘢痕量表（VSS）雷达图，比较不同组之间的色素沉着、柔软度、血管化和瘢痕高度。n) 以H2S为中心的“神经-免疫-血管”调控机制示意图，顺利获得抑制TGF-β/Smad和NF-κB/MAPK信号通路实现瘢痕抑制。