K8·凯发(中国)

研究背景：

示意图. CITED2负载水凝胶喷雾靶向巨噬细胞重编程

（1）CITED2在正常创面愈合中呈阶段特异性表达，且在糖尿病创面中表达受抑

GEO数据库（GSE460、GSE97615）分析显示，非糖尿病创面中CITED2基因表达呈动态变化：愈合初期迅速升高，炎症期逐渐下降，增殖期再次上调，重塑期下调。单细胞空间转录组学数据进一步证实，与第0天相比，巨噬细胞中CITED2表达于第1天下降、第7天升高、第30天再次下降；M1型巨噬细胞中CITED2呈现相同的时序波动模式，而M2型巨噬细胞中CITED2表达始终维持在较低水平。免疫荧光分析证实，正常小鼠创面组织内CITED2与巨噬细胞标志物F4/80显著共定位。

GEO数据库（GSE154556）分析及STZ诱导糖尿病小鼠、db/db糖尿病小鼠创面模型均显示，糖尿病创面中CITED2基因表达显著下调。创面第3天时，M1型巨噬细胞标志物CD68、CD80及促炎细胞因子IL-1β表达上调，IL-4、IL-10及CITED2 mRNA表达显著降低。体外实验进一步证实，35 mM高糖培养促使巨噬细胞呈现M1型形态（圆形、多伪足），且CITED2 mRNA表达显著低于正常葡萄糖组。上述结果表明，糖尿病创面中CITED2表达受抑，阻碍炎症期M1型巨噬细胞向M2型转化，导致炎症持续，进而损害创面愈合。

图1. CITED2在创面愈合过程中呈阶段特异性表达，且在糖尿病创面中表达下调。(A-B) 非糖尿病创面愈合过程中CITED2基因的表达。(C-F) 正常创面愈合过程中单细胞水平空间转录组学数据中CITED2的动态表达。(G) 糖尿病创面中CITED2基因的表达（n=3）。(H-I) 两种糖尿病小鼠创面模型的外观及愈合率。(J-K) 糖尿病创面中CITED2基因的mRNA表达水平（比例尺=5 mm，n=3）。(L) 高糖处理后巨噬细胞的形态学变化（比例尺=100 μm）。(M) 高糖处理后巨噬细胞中CITED2基因的mRNA表达水平（n=3）。

（2）重组CITED2蛋白顺利获得促进再上皮化、胶原沉积和血管生成加速糖尿病创面愈合

重组CITED2蛋白（28 kDa）结构分析显示其无跨膜结构域及信号肽序列。氨基酸序列优化后，将合成基因亚克隆至pET-22b(+)载体（NdeI和XhoI酶切位点），经His标签纯化，所得重组蛋白纯度超过80%，SDS-PAGE证实其分子量介于25–35 kDa之间。

在db/db糖尿病小鼠创面模型中，造模后第1、2、3天于创缘皮下注射不同剂量（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg）的重组CITED2蛋白。各剂量组创面愈合速度均优于对照组，其中0.1 μg剂量（相当于1 μg/mL，每次100 μL）效果最佳，后续实验均采用该剂量。第7天HE染色显示，CITED2组创面宽度显著小于对照组；第14天HE和Masson三色染色显示，CITED2组创面完全再上皮化，肉芽组织丰富，胶原沉积明显增加，对照组则结痂明显、再上皮化不完全、胶原沉积减少。免疫荧光染色显示，第7天CITED2处理组血管生成标志物CD31表达显著增加，VEGF-A、PDGF和TGFβ等促血管生成生长因子显著上调；第14天CD31和α-SMA表达均显著上调，提示CITED2不仅促进血管生成，还加速血管成熟。上述结果表明，局部应用重组CITED2蛋白可顺利获得促进再上皮化、增加胶原沉积和增强血管生成加速糖尿病创面愈合。

图2. 重组CITED2蛋白顺利获得促进再上皮化、胶原沉积和血管生成加速糖尿病创面愈合。(A) 重组CITED2蛋白合成示意图。(B) 不同浓度重组CITED2蛋白处理的糖尿病小鼠创面外观（比例尺=5 mm）。(C) 创面愈合率。(D-E) 第7天和第14天糖尿病小鼠创面的HE染色及定量分析（比例尺=1 mm，n=3）。(F-G) 第7天和第14天糖尿病小鼠创面的Masson染色及定量分析（比例尺=1 mm，n=3）。(H-J) 第7天糖尿病小鼠创面α-SMA和CD31的免疫荧光染色及定量分析（比例尺=100 μm，n=3）。(K-M) 第14天糖尿病小鼠创面α-SMA和CD31的免疫荧光染色及定量分析（比例尺=100 μm）。

（3）转录组学揭示CITED2激活PPAR信号通路并上调抗炎基因

为明确CITED2促进糖尿病创面愈合的分子机制，对治疗第7天的对照组和CITED2组创面组织进行转录组测序。火山图分析显示，重组CITED2蛋白处理后共有422个差异表达基因。热图所示前10个上调基因中，抗炎基因Gpnmb和Nr1d1显著升高，并经RT-qPCR验证。GO分析表明，CITED2增强了与免疫系统应答相关的生物学过程；KEGG通路分析显示，CITED2处理的创面中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路上调，RT-qPCR证实PPAR-γ表达升高。鉴于PPAR-γ是巨噬细胞M2极化的主调控因子，上述结果提示CITED2可能顺利获得诱导巨噬细胞向M2表型极化发挥抗炎作用。

GO生物学过程分析进一步揭示，免疫系统相关过程（包括防御反应、固有免疫和适应性免疫激活）显著富集；细胞组分分析显示，信号受体结合功能受影响最显著，并伴随细胞外基质成分和受体-配体活性的调节；分子功能分析显示细胞外结构区域显著富集，提示存在活跃的组织重塑。基因集富集分析（GSEA）证实，免疫反应正调控、抗原加工与提呈以及代谢重编程（细胞脂质代谢、PPAR信号通路、亚油酸代谢）等关键生物学通路上调，增强的受体-配体活性提示细胞间通讯改善。上述发现支持CITED2促进巨噬细胞M2极化的假说。

图3. CITED2处理糖尿病小鼠创面的Bulk RNA测序分析。(A) 火山图。(B) 基因表达热图。(C) 第7天Nrad1和Gpnmb基因mRNA表达的RT-qPCR检测（n=3）。(D) GO富集分析。(E) KEGG富集分析。(F) 第7天PPARγ mRNA表达的RT-qPCR检测（n=3）。(G) CITED2处理后第7天生物学过程、细胞组分和分子功能分析。(H) GSEA富集分析。

（4）CITED2驱动巨噬细胞向M2表型转化，重塑创面炎症微环境

为验证上述假说，对第7天创面组织进行免疫荧光染色。结果显示，与对照组相比，CITED2组M2型巨噬细胞标志物CD206表达增加，M1型标志物iNOS表达降低。炎症因子检测进一步显示，CITED2处理的创面中促炎基因（IL-6、IL-1β、TNF-α）表达下调，抗炎基因（IL-10、Gpnmb、Nr1d1）表达上调。上述结果证实，CITED2驱动巨噬细胞向M2表型极化，抑制促炎反应并增强抗炎信号，从而加速糖尿病小鼠创面愈合。这一过程可能形成正反馈环路：CITED2顺利获得PPAR-γ通路促进M2极化，M2巨噬细胞分泌的IL-10进一步激活PPAR-γ信号，从而维持稳定的抗炎微环境。

图4. 糖尿病小鼠第7天创面的免疫荧光染色。(A-C) 巨噬细胞标志物CD206和iNOS的免疫荧光染色及定量分析结果。(D-F) IL-6和IL-1β的免疫荧光染色及定量分析结果。(G-I) TNF-α和IL-10的免疫荧光染色及定量分析结果。(J-L) Gpnmb和Nr1d1的免疫荧光染色及定量分析结果。比例尺=50 μm，n=3。

（5）CITED2重编程巨噬细胞，促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖与迁移

已有研究表明，M2型巨噬细胞顺利获得分泌VEGF、TGF-β、PDGF和IGF-1等生长因子营造再生微环境，对内皮细胞和成纤维细胞发挥协调作用：M2来源的VEGF强力刺激内皮细胞迁移、增殖和新生血管化，TGF-β促进血管成熟；TGF-β和PDGF激活成纤维细胞，驱动其增殖并向分泌细胞外基质的肌成纤维细胞分化，IGF-1进一步增强胶原合成与基质重塑。

体外实验进一步考察高糖（35 mM）条件下经CITED2重组蛋白处理的巨噬细胞条件培养基（CITED2-CM）对内皮细胞和成纤维细胞增殖与迁移的影响。结果显示，35 mM高糖组巨噬细胞呈M1样形态，35 mM+CITED2组呈M2样形态；RT-qPCR分析显示，与35 mM组相比，35 mM+CITED2组M1标志物CD80表达降低，M2标志物CD206表达升高，证实CITED2促进巨噬细胞M2极化。EdU实验表明，与对照组相比，CITED2-CM组内皮细胞和成纤维细胞增殖均增强；划痕实验进一步显示，CITED2-CM组显著促进两种细胞的迁移。上述结果表明，CITED2在高糖条件下将巨噬细胞重编程为M2表型，进而增强内皮细胞和成纤维细胞的增殖与迁移能力，促进创面愈合。

图5. CITED2调控M2型巨噬细胞极化，促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖与迁移。(A) 示意图。(B) 不同培养基中巨噬细胞的形态。(C) 高糖环境下CITED2干预后巨噬细胞标志物CD80和CD206 mRNA表达的RT-qPCR检测。(D-E) 内皮细胞和成纤维细胞的EdU染色及定量分析。(F-G) 内皮细胞和成纤维细胞的划痕实验及定量分析（比例尺=200 μm，n=3）。

（6）Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶喷雾的制备与表征

为减少反复注射带来的疼痛与感染风险并延长CITED2在创面局部的生物活性，开发了一种负载重组CITED2蛋白的外用型水凝胶喷雾。将PEG化的CITED2加入纤维蛋白原溶液形成流动性良好的混合液（Fib-PEG-CITED2，溶液A），与凝血酶溶液（溶液B，10 NIH U/mL）等体积混合后，即可在创面原位成胶，形成Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶。PEG的亲水性可延缓重组CITED2蛋白降解，PEG与CITED2混合后的降解速率实验证实PEG减缓了CITED2蛋白降解，表现出一定的缓释效果。

考察不同PEG比例（50/60/70/80 μL）下纤维蛋白水凝胶（10 mg/mL Fib，100 μL + 10 u/mL Thr，100 μL）的成胶情况：添加50、60、70 μL PEG的实验组均可成胶，80 μL组无法成胶；随PEG用量增加，成胶时间逐渐延长，50 μL组成胶时间与未加PEG的纤维蛋白水凝胶相同，故后续实验采用50 μL PEG。定量结果显示，Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶的CITED2蛋白负载率超过90%，72小时内CITED2累积释放率达70%。制备成功的水凝胶可牢固粘附于培养皿，在猪皮上紧密贴合且随皮肤形变不脱落。降解实验显示该水凝胶第6天降解约90%，与Fib-Thr和Fib-Thr-PEG组无显著差异。扫描电镜显示，Fib-Thr组呈陆续在、不规则、相互连通的多孔三维网络结构，加入PEG后，Fib-Thr-PEG和Fib-Thr-PEG-CITED2组呈现无孔三维结构。

生物安全性评价显示，溶血实验中各水凝胶组溶血率均低于5%，具有良好的血液相容性；死细胞染色显示Fib-Thr-PEG-CITED2组与对照组无显著差异，证实其无细胞毒性。体外凝血实验和小鼠肝脏出血模型进一步证实，Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶具有与Fib-Thr水凝胶相当的止血能力，可快速有效促进血液凝固。

图6. Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶喷雾的制备与表征。(A) 水凝胶制备示意图（经Figdraw绘制）。(B) 水凝胶固化前后的实拍图。(C) 水凝胶的喷雾状态及水凝胶膜。(D) 水凝胶在猪皮上的粘附性。(E) 扫描电镜下水凝胶的形貌观察（比例尺=100 μm/20 μm）。

（7）Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶喷雾加速糖尿病创面体内愈合

在db/db糖尿病小鼠创面模型中，从造模第0天起给予水凝胶喷雾干预。结果显示，局部应用Fib-Thr-PEG-CITED2喷雾可显著加速糖尿病小鼠创面愈合。第14天HE染色显示，CITED2组与Fib-Thr-PEG组创面结构无显著差异，Fib-Thr-PEG-CITED2组创面宽度最窄；Masson三色染色显示，Fib-Thr-PEG-CITED2组胶原沉积更丰富、更成熟；免疫荧光结果显示，与其他组相比，Fib-Thr-PEG-CITED2组α-SMA和CD31表达最高，血管新生和成熟程度更高。该水凝胶喷雾的创面愈合率与皮下注射CITED2相当，实现了无创给药下的等效疗效。

对第7天创面组织进行免疫荧光染色，以比较各水凝胶处理组与对照组之间的巨噬细胞表型转换。结果显示，与CITED2组和Fib-Thr-PEG组相比，Fib-Thr-PEG-CITED2组修复性巨噬细胞标志物CD206表达显著增加，促炎标志物iNOS明显减少；Fib-Thr-PEG组CD206表达也有所升高，但程度弱于CITED2组，提示纤维蛋白基质本身营造的温和促修复微环境经CITED2进一步放大为促消退极化。上述结果表明，CITED2负载水凝胶介导的M1向M2表型转换促进糖尿病创面愈合。

在与临床常用rhFGF的疗效对比中，短期（3天）CITED2治疗与陆续在14天rhFGF治疗的创面愈合效果相当，且心、肝、脾、肾等主要脏器HE染色未见明显差异，生物安全性良好。与仅靶向基质细胞而无法纠正糖尿病免疫抑制微环境的传统疗法（如rhFGF）不同，CITED2作为"主调控因子"，顺利获得PPAR-γ信号通路靶向失调的巨噬细胞极化以消除慢性炎症；Fib-Thr-PEG水凝胶并非单纯的被动载体，其纤维蛋白基质本身固有地营造促修复微环境，两者发挥协同效应。

图7. Fib-Thr-PEG-CITED2水凝胶喷雾加速糖尿病创面体内愈合。(A) 糖尿病小鼠创面建模及处理示意图。(B-C) 水凝胶处理后糖尿病小鼠的创面愈合率（比例尺=5 mm）。(D) 第14天创面组织HE染色及定量分析（比例尺=1 mm）。(E) 第14天创面组织Masson染色（比例尺=100 μm）。(F-G) 第14天创面组织HE染色和Masson染色的定量分析（n=3）。(H-J) 第14天创面组织α-SMA和CD31的免疫荧光染色及定量分析（比例尺=50 μm）。