K8·凯发(中国)

研究背景：

方案1. KPBIT@NPs的构建及抗AD机制示意图。

（1）两亲性多糖衍生物的构建及纳米颗粒的表征

以三七多糖（PNP）为骨架接枝4-羧基苯硼酸频哪醇酯（CPBA）并偶联KLVFFAED肽（KLV），制得肽功能化两亲性多糖（图1A、B）。¹H NMR显示CPBA与肽的芳香质子信号出现且骨架信号保留（图1C、D），FTIR在约1730 cm⁻¹出现酯羰基峰（图1E）。接枝度随CPBA投料由0.87%升至13.61%，8.95%时CAC最低（0.697→0.0358 mg/mL），过高则聚集失稳，故选接枝度8.95%者。共组装得KPBIT@NPs，CAC为0.0216 mg/mL（图1F），丁达尔效应证实胶束形成（图1G），ICT与TS IIA特征红外峰消失，包封率分别为(92.10±2.09)%和(87.49±1.93)%。颗粒呈均一准球形（图1I、J；对照图1H），粒径79.33±0.19 nm（图1L），PDI 0.0593，Zeta电位−2.10 mV（图1M）。4 ℃储存14天及10% FBS中粒径增幅分别为13.5%和20.6%，PDI<0.24，无突发聚集。H₂O₂孵育致颗粒碎裂（图1K），释药仅在ROS条件下显著加速（图1N）。

图1. ROS响应性纳米制剂的合成与理化性质表征。a) PNP-CPBA的合成路线。b) KLV-PNP-CPBA的合成路线。c) PNP-CPBA的¹H NMR谱图。d) KLV-PNP-CPBA的¹H NMR谱图。e) 原料、游离药物及载药制剂的FTIR光谱。f) KPBIT@NPs的临界聚集浓度（CAC）。g) KPB@NPs、KPBIT@NPs、游离ICT和游离TS IIA在水溶液中的照片。h) PNP的SEM图像，比例尺：2 μm。i) KPBIT@NPs的SEM图像，比例尺：2 μm。j) KPBIT@NPs的TEM图像，比例尺：100 nm。k) 纳米颗粒在含100 μM H₂O₂的PBS（pH 7.4）中室温孵育24 h氧化处理后的TEM图像，比例尺：100 nm。l) KPBIT@NPs的粒径分布。m) KPBIT@NPs的Zeta电位。n) KPBIT@NPs中ICT在PBS、10% FBS及不同浓度H₂O₂溶液（0.1–100 μM及1 mM）中的累积释放曲线（n = 3）。

（2）纳米制剂增强细胞摄取、血脑屏障穿透与脑靶向

在AD-bEnd.3细胞模型中，香豆素-6标记实验显示，KLV修饰的KPBC@NPs较未修饰PBC@NPs细胞内荧光显著更强（P < 0.001）；RAGE抑制剂FPS-ZM1预处理显著降低摄取（P < 0.05），提示摄取经RAGE相关识别介导（图2A、B）。在AD-BV2模型中同样观察到FP敏感的摄取增强（P < 0.05）（图2C、D）。Transwell共培养BBB模型中，Aβ/LPS刺激后TEER由212.2±12.6降至189.1±4.5 Ω·cm²，Na-FLU渗透系数由1.92增至2.76×10⁻⁶ cm/s，证实为部分受损BBB；下室AD-BV2细胞内KPBC@NPs荧光显著强于PBC@NPs（P < 0.0001），表明KLV修饰促进纳米颗粒跨受损内皮屏障及后续摄取（图2E–G）。体内DIR标记静脉注射SD大鼠：KPBD@NPs循环时间长于PBD@NPs，72 h仍可检测到荧光（图2H、I）。AD小鼠活体成像显示KPBD@NPs脑蓄积信号更强并持续至72 h（图2J、K）；离体成像显示其脑内信号强于非靶向组（图2L、M）。

图2. 纳米制剂在体外和体内增强细胞摄取、BBB穿透及脑靶向能力。a) AD-bEnd.3细胞经不同制剂处理后的摄取代表性荧光图像，比例尺：50 μm。b) (A)中细胞摄取的半定量分析（n = 3）。c) AD-BV2细胞摄取的代表性荧光图像，比例尺：50 μm。d) (C)中细胞摄取的半定量分析（n = 3）。e) 基于Transwell的体外BBB模型示意图。f) 共培养BBB模型中经不同制剂处理后AD-BV2细胞摄取的代表性荧光图像，比例尺：100 μm。g) (F)中AD-BV2细胞摄取的半定量分析（n = 3）。h) 给予不同制剂后大鼠血液在不同时间点的荧光信号强度。i) (H)中血液荧光强度的半定量分析（n = 3）。（÷：PBD@NPs vs KPBD@NPs）j) 给予不同制剂后APP/PS1小鼠的实时活体荧光成像。k) 与(J)对应的脑组织荧光强度半定量分析（n = 3）。（：PBD@NPs vs KPBD@NPs；#：DIR vs KPBD@NPs）l) 主要器官离体荧光成像。m) 与(L)对应的组织荧光强度半定量分析（n = 3）。

（3）ICT与TS IIA协同神经保护效应的评价及共载比例的优化

在Aβ+LPS构建的BV2细胞损伤模型中，基于细胞活力的挽救效应评价ICT与TS IIA的协同神经保护作用。SynergyFinder平台定量分析（以Synergy Score ≥10判定为显著协同）显示，ICT:TS IIA = 2:5（比例1）、4:5（比例2）和1:1（比例3）三种摩尔比的组合Synergy Score均≥10，表明该比例范围内对Aβ+LPS诱导的小胶质细胞损伤具有显著协同细胞保护效应。

据此比例制备单药纳米颗粒（KPBI@NPs、KPBT@NPs）及双药共载纳米颗粒（KPBIT@NPs-1/2/3）。流式细胞术检测BV2细胞M1→M2极化：与单药制剂相比，双药共载制剂更有效地降低M1标志物CD86表达、升高M2标志物CD206表达，其中KPBIT@NPs-3（ICT:TS IIA = 1:1）抑制M1极化、促进M2极化的效果最为显著。将处理后的BV2条件培养基作用于HT22神经元，凋亡分析显示双药制剂较单药制剂显著减少HT22神经元凋亡，KPBIT@NPs-3神经保护效果最佳；Calcein-AM/PI双染证实其显著提高HT22细胞活力。据此，ICT与TS IIA 1:1摩尔比被选定为后续体内外治疗及机制研究的最佳共载比例。

（4）KPBIT@NPs抑制氧化应激并促进小胶质细胞表型重编程

Aβ沉积和损伤相关分子模式被小胶质细胞模式识别受体识别，触发其向促炎M1表型极化并释放IL-1β、TNF-α等细胞因子；炎症激活中过量的ROS进一步损伤线粒体、放大炎症信号。流式细胞术检测显示，各处理组均可不同程度降低Aβ+LPS刺激的BV2细胞内ROS水平，其中KPBIT@NPs效果最显著（图3B、C：模型组CD86平均荧光强度71.70，KPBIT@NPs组降至32.90）。炎症与抗氧化指标检测显示：空白载体KPB@NPs表现出中等抗炎活性；KPBIT@NPs显著降低促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，明显升高抗炎标志物Arg-1和IL-10水平；氧化应激指标方面，KPBIT@NPs显著降低MDA水平，并明显提高GSH含量和CAT活性，各组中效果最为突出（图3D–F）。

形态学观察显示，对照组BV2细胞小而致密、呈圆形或卵圆形；Aβ+LPS刺激后细胞铺展增大、轮廓不规则并局部聚集；游离药或非靶向纳米颗粒仅部分逆转上述改变；KPBIT@NPs处理后梭形、带突起的细胞明显增多（图3G）。免疫荧光与流式细胞术结果一致：模型组CD86/CD206平衡向促炎方向偏移，KPBIT@NPs处理显著降低CD86阳性细胞比例（图4H、I、M），并进一步提升CD206表达（图3J、K、N：CD206平均荧光强度由对照组5.13升至KPBIT@NPs组62.60）。JC-1线粒体膜电位检测显示，KPBIT@NPs显著恢复模型组受损的线粒体膜电位（图3L、O），提示其兼具抑制促炎极化与维护线粒体稳态的作用。

图3. 纳米制剂在BV2细胞中协同降低氧化应激、抑制M1极化并恢复线粒体功能。a) 游离ICT与游离TS IIA的最高单药（HSA）协同分析。b) 流式细胞术分析不同制剂处理后BV2细胞内ROS水平。c) (B)中ROS水平的定量分析。d–f) 处理后BV2细胞上清中氧化应激相关生物标志物（MDA、GSH和CAT）水平。g) BV2细胞明场图像，比例尺：50 μm。h) CD86表达的流式细胞术分析。i) BV2细胞中CD86（M1标志物）表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。j) BV2细胞中CD206（M2标志物）表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。k) CD206表达的流式细胞术分析。l) JC-1染色显示BV2细胞线粒体膜电位，比例尺：100 μm。m) (I)中CD86表达的半定量分析。n) (J)中CD206表达的半定量分析。o) (L)中线粒体膜电位的半定量分析。

（5）网络药理学与分子对接提示ICT和TS IIA的协同抗AD机制

基于"补肾活血"治则，采用网络药理学预测ICT与TS IIA协同抗AD机制：共收集48个活性成分、736个潜在药物靶点，与16,820个AD相关靶点取交集取得688个共同靶点；PPI网络分析识别出HIF-1α、mTOR等枢纽靶点（图4A）。GO/KEGG富集分析鉴定164条显著富集通路（P < 0.05），前20条包括AMPK、mTOR及神经炎症相关通路（图5F）。分子对接显示ICT与AMPK、TS IIA与AMPK、ICT与mTOR、TS IIA与mTOR的结合能分别为(−8.17±0.05)、(−9.70±0.64)、(−7.17±0.52)、(−8.83±0.82) kcal/mol（图4B–E、G），均低于−5.0 kcal/mol，氢键与疏水作用为主要结合力。WB分析显示，模型组p-AMPK/AMPK显著下降、p-mTOR/mTOR和HIF-1α显著升高；KPBIT@NPs显著逆转上述变化，效果优于游离药及非靶向PBIT@NPs（图4H–K），并显著降低PFKFB3表达和p-PDHE1α水平（图4L–N）。

图4. ICT和TS IIA顺利获得激活AMPK-mTOR/HIF-1α信号轴及代谢重编程调控BV2极化。a) 核心靶点的蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）网络。b–e) ICT和TS IIA与AMPK和mTOR结合相互作用的分子对接分析。f) 潜在治疗靶点的KEGG通路富集分析，突出显示AMPK和mTOR信号通路的参与。g) 与(B–E)对应的结合能定量分析（n = 3）。h) AMPK和mTOR信号通路蛋白的Western blot分析。i–k) p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR和HIF-1α表达水平的定量分析（n = 3）。l) 代谢酶PDHE1α和PFKFB3的Western blot分析。m–n) p-PDHE1α/PDHE1α和PFKFB3表达水平的定量分析（n = 3）。

（6）AMPK-mTOR/HIF-1α信号调控小胶质细胞极化与代谢的药理学验证

为明确AMPK与mTOR是否参与KPBIT@NPs对小胶质细胞免疫代谢的调控，采用AMPK抑制剂Compound C和mTOR激活剂MHY1485进行药理学干预。Compound C预处理显著削弱KPBIT@NPs上调p-AMPK/AMPK比值的能力，减弱其对p-mTOR和HIF-1α的抑制效应，其对CD86下调和CD206上调的调控亦明显减弱（图5A–G）。MHY1485显著逆转KPBIT@NPs对p-mTOR荧光强度的抑制（P < 0.0001），恢复HIF-1α表达及其核转位（图5H–L），并在蛋白水平削弱KPBIT@NPs对p-mTOR、HIF-1α的抑制及对CD86/CD206的调控（图5M–R）。上述结果表明，AMPK激活联合mTOR抑制参与KPBIT@NPs驱动的小胶质细胞表型转变与代谢重编程。

图5. 纳米制剂调控BV2极化的AMPK-mTOR/HIF-1α信号药理学验证。(A–G)组：a) 不同处理组AMPK–mTOR信号通路蛋白的Western blot分析。b–d) 与(A)对应的p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR和HIF-1α表达水平定量分析。e) CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）的Western blot分析。f–g) 与(E)对应的CD86和CD206表达定量分析。(H–R)组：h) BV2细胞中p-mTOR表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。i) (H)中p-mTOR荧光强度的半定量分析。j) HIF-1α表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。k) HIF-1α与核染色的荧光强度分布曲线，显示核定位改变。l) (J)中HIF-1α荧光强度的半定量分析。m) 药理学调控条件下p-mTOR、总mTOR、HIF-1α及内参的Western blot分析。n–o) 与(M)对应的p-mTOR/mTOR和HIF-1α表达定量分析。p) 通路干预下CD86和CD206表达的Western blot分析。q–r) 与(P)对应的CD86和CD206表达定量分析。

（7）KPBIT@NPs将BV2细胞代谢从糖酵解重编程为氧化磷酸化

免疫荧光显示，KPBIT@NPs较模型组显著降低糖酵解标志物LDHA荧光强度，该抑制作用被MHY1485显著削弱（图6A、C）；同时，OXPHOS标志物ATP5A荧光强度在KPBIT@NPs组显著升高，联合MHY1485后该效应明显减弱（图6B、H）。

实时代谢通量分析显示：模型组细胞外酸化率（ECAR）显著升高、耗氧率（OCR）显著降低；KPBIT@NPs处理显著降低糖酵解能力、糖酵解储备及总体糖酵解活性（图6D–G），同时显著提高基础呼吸、ATP生成、最大呼吸及储备呼吸能力（图6I–M）。分子水平上，KPBIT@NPs显著降低p-PDHE1α/PDHE1α比值和PFKFB3表达；Compound C共处理明显削弱上述调控，MHY1485共处理同样显著损害KPBIT@NPs对这些分子标志物的调节（图6N–S）。

图6. 纳米制剂经AMPK-mTOR信号通路将BV2细胞代谢从糖酵解重编程为氧化磷酸化。a) BV2细胞中LDHA（糖酵解标志物）表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。b) ATP5A（线粒体氧化磷酸化标志物）表达的免疫荧光图像，比例尺：50 μm。c) 与(A)对应的LDHA荧光强度半定量分析。d) 代表性细胞外酸化率（ECAR）曲线。e–g) 糖酵解能力、糖酵解储备和糖酵解活性的定量分析，提示糖酵解受抑。h) 与(B)对应的ATP5A荧光强度半定量分析。i) 代表性耗氧率（OCR）曲线。j–m) 基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和储备呼吸能力的定量分析，提示线粒体氧化磷酸化增强。n) AMPK抑制（Compound C）条件下代谢酶（PDHE1α和PFKFB3）的Western blot分析。o) mTOR激活（MHY1485）条件下代谢酶的Western blot分析。p–q) 与(N)对应的蛋白表达定量分析。r–s) 与(O)对应的蛋白表达定量分析。(N)组：1.对照，2.模型，3.KPBIT@NPs，4.Compound C，5.KPBIT@NPs+Compound C；(O)组：1.对照，2.模型，3.KPBIT@NPs，4.MHY1485，5.KPBIT@NPs+MHY1485。

（8）KPBIT@NPs顺利获得调控小胶质细胞旁分泌发挥间接神经保护作用

为明确观察到的神经毒性是否由BV2来源条件培养基（CM）介导而非培养体系中残留刺激物所致，设置系统对照：仅CM处理可显著降低HT22细胞活力，而含刺激物的新鲜培养基、未经处理的BV2-CM以及无细胞暴露的等时长刺激物培养基均未表现出显著差异，证明神经毒性主要由BV2来源CM介导（图7B、C）。

将不同处理组的BV2-CM作用于HT22神经元：KPBIT@NPs组CM显著提高HT22细胞活力（图7B）；Calcein-AM/PI染色显示活细胞（绿色）增多、死细胞（红色）减少，细胞死亡率显著低于模型组且优于PBIT@NPs（图7D、I）。流式凋亡分析显示，KPBIT@NPs-CM显著降低HT22凋亡细胞比例，并显著抑制早期凋亡的启动（图7F、G）。氧化应激方面，KPBIT@NPs-CM显著减少HT22细胞内ROS蓄积（图7E、J），流式定量结果与成像一致（图7H、K）。

图7. 小胶质细胞重编程介导的神经保护对抗神经元氧化应激与凋亡。a) HT22神经元与BV2细胞来源条件培养基共培养的示意图。b) 不同组CM处理HT22细胞的细胞活力（n = 6）。c) 排除残留刺激物（Aβ+LPS、ICT/TS IIA、PBIT@NPs、KPBIT@NPs）对HT22细胞直接作用的对照实验（n = 6）。d) CM孵育12 h后HT22细胞的代表性活/死染色图像，比例尺：50 μm。e) HT22细胞内ROS水平的代表性荧光图像，比例尺：50 μm。f) HT22细胞凋亡的流式细胞术分析。g) 与(F)对应的凋亡率定量分析（n = 3）。h) HT22细胞ROS水平的流式细胞术分析。i) 与(D)对应的细胞死亡率定量分析（n = 3）。j) 与(E)对应的ROS荧光强度半定量分析（n = 3）。k) 与(H)对应的ROS水平定量分析（n = 3）。

（9）KPBIT@NPs改善AD小鼠认知功能并缓解神经病理损伤、逆转脑内炎症与代谢失衡

在APP/PS1小鼠中评价KPBIT@NPs的体内疗效。Morris水迷宫试验中，KPBIT@NPs组轨迹更集中于目标象限（图8A），逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间及穿台次数增加（图8F–H）；筑巢评分显著高于模型组（图8B、I）。病理层面，KPBIT@NPs显著缩小海马和皮层Aβ斑块、降低染色强度（图8C、J）；脑组织结构及神经元层化改善（图8D、K）；NeuN阳性神经元数量增加（图8E、L）；树突长度与分支恢复（图8M）；线粒体超微结构损伤减轻（图8N）。机制层面，KPBIT@NPs抑制胶质细胞异常激活（图9A、C、F、G），下调CD86、上调CD206，促小胶质细胞M1→M2极化（图9B、E、H–J、P、Q）；抗炎因子IL-10、Arg-1升高，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α降低（图9K–O）。脑能量代谢方面，KPBIT@NPs整体纠正三羧酸循环关键酶、呼吸链复合体活性下降及乳酸、丙酮酸蓄积（图9U），并恢复p-AMPK/p-mTOR/HIF-1α失衡（图9D、R–T）。安全性方面，主要器官H&E未见异常，溶血率低于阈值，血液学参数及血清炎症因子无显著异常。

图8. 纳米制剂缓解APP/PS1小鼠的认知障碍、Aβ病理及神经元损伤。a) Morris水迷宫第6天小鼠游泳轨迹代表性图像。b) 24 h内筑巢行为代表性图像。c) 皮层和海马DG区Aβ斑块的免疫组化染色，比例尺：50 μm。d) 皮层和海马DG区神经元结构的尼氏染色，比例尺：50 μm。e) NeuN（神经元标志物）免疫荧光染色，比例尺：75 μm。f) 逃避潜伏期。（：对照 vs 模型；#：KPBIT@NPs vs 模型）g) 目标象限停留时间。h) 穿台次数。i) 筑巢评分定量分析。j) Aβ斑块负荷的半定量分析。k) 海马DG区尼氏体阳性面积的半定量分析。l) NeuN荧光强度的半定量分析。m) 高尔基染色显示海马神经元树突形态，比例尺：1.0 μm。n) 线粒体形态超微结构分析，红色箭头指示线粒体，比例尺：1.0 μm。

图9. 纳米制剂重塑APP/PS1小鼠的神经炎症微环境、小胶质细胞极化及相关的代谢改变。a) 皮层和海马DG区GFAP（星形胶质细胞激活标志物）免疫组化染色，比例尺：50 μm。b) 脑组织中CD86和CD206蛋白表达的Western blot分析。c) IBA-1（小胶质细胞标志物）免疫组化染色，比例尺：75 μm、50 μm。d) AMPK、mTOR和HIF-1α蛋白表达的Western blot分析。e) CD86/IBA-1（M1表型标志物）免疫荧光染色，比例尺：50 μm。f) GFAP阳性面积的半定量分析（n = 6）。g) IBA-1阳性面积的半定量分析（n = 6）。h) CD206/IBA-1（M2表型标志物）免疫荧光染色，比例尺：50 μm。i) CD86荧光强度的半定量分析（n = 6）。j) CD206荧光强度的半定量分析（n = 6）。k–l) 抗炎因子（IL-10和Arg-1）表达水平（n = 6）。m–o) 促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）表达水平（n = 6）。p–q) 与(B)对应的蛋白表达定量分析（n = 3）。r–t) 与(D)对应的蛋白表达定量分析（n = 3）。u) 脑组织线粒体相关代谢检测，提示脑内整体代谢改变（n = 6）。