K8·凯发(中国)

研究背景：

方案1. 细胞骨架依赖的可转移线粒体状态编程用于血管化骨再生的示意图。a) DEX@LDH/MET纳米杂化平台的合成；b) 体外机制：细胞骨架-线粒体重焕新生；c) 细胞间串扰与内皮血管生成；d) 体内应用与骨小梁微结构；e) 核心生物学功能及潜在机制总结。

（1）DEX@LDH/MET纳米复合物的设计与结构表征

顺利获得层级组装MgAl-LDH纳米片、LDH/ChS/MET复合物及DEX-CM-β-CD包合物，构建了DEX@LDH/MET纳米杂化物（图1A）。SEM/TEM显示其为形貌规整的六方纳米片，横向尺寸60–100 nm（图1B,C）；HRTEM证实晶格间距由0.212 nm增至0.223 nm，表明客体分子部分嵌入（图1D）。ζ电位由+36.2 mV降至−20.7 mV，证实ChS/MET经静电作用吸附；水动力粒径由108.4 nm增至447.9 nm，在PBS及含血清培养基中分散稳定性良好。XRD显示结晶DEX特征峰消失，表明其以分子水平分散，有利于提高生物利用度（图1E）；相溶解度分析呈典型1:1包合特征，K₁:₁为2934.82 M⁻¹。FTIR与XPS证实DEX包封及药物在LDH上的成功负载（图1F–I）。释放实验显示，第14天pH 6.5下Mg²⁺累积释放为LDH对照的2.18倍，利于酸性微环境胞内递送；DEX与MET均呈先快速后缓释特征（图1J,K）。细胞实验表明250 μg mL⁻¹下细胞活力仍超80%，溶血率低于5%，证实其优异的生物安全性。

图1. DEX@LDH/MET纳米复合物的设计与结构表征。a) DEX@LDH/MET纳米杂化物层级组装的示意图；b) MgAl-LDH、LDH/MET和DEX@LDH/MET的SEM图像；c) MgAl-LDH、LDH/MET和DEX@LDH/MET纳米片的TEM图像；d) MgAl-LDH和DEX@LDH/MET的HRTEM图像；e) 纯LDH和DEX@LDH/MET的XRD图谱；f) DEX-CM-β-CD、LDH/ChS/MET、DEX@LDH/MET的FTIR光谱；g–i) 用于元素组成鉴定的XPS分析；j) LDH和DEX@LDH/MET在不同pH条件（pH 6.5、7.4和8.0）下14天内Mg²⁺和Al³⁺离子的累积释放百分比；k) DEX@LDH/MET在PBS（pH 7.4）中14天内DEX和MET的持续释放曲线。

（2）DEX@LDH/MET诱导rBMSCs体外成骨分化

评估了DEX@LDH/MET在大鼠BMSCs中的骨诱导潜能以确定最佳诱导剂量（图2A）。ALP染色显示早期成骨分化呈剂量依赖性增强，1–10 μg mL⁻¹范围内染色强度逐渐加深（图2B），定量分析证实5、7.5和10 μg mL⁻¹组ALP活性显著升高（图2D）。茜素红S染色显示钙结节增多、矿化沉积更广，其中5 μg mL⁻¹组矿化结节面积显著增加（图2C,E）。qPCR分析显示第14天成骨标志物RUNX2、OSX、BMP2和OCN表达显著上调（图2F），提示成骨定向增强及成熟成骨表型的取得。免疫荧光显示RUNX2、BMP2及ACTIN表达升高，其中RUNX2和BMP2信号在2.5和5 μg mL⁻¹下显著增强，ACTIN增加反映支持成骨的细胞骨架重塑（图2G–O）。5 μg mL⁻¹下细胞内NAD⁺/NADH比值升高最显著，提示氧化还原平衡与能量代谢增强。上述结果表明，DEX@LDH/MET不仅顺利获得生化线索促进成骨，还可经细胞骨架组织与机械转导驱动成骨定向，最佳作用剂量确定为5 μg mL⁻¹。

图2. DEX@LDH/MET诱导rBMSCs体外成骨分化。a) DEX@LDH/MET诱导rBMSCs成骨分化的示意图；b) 不同浓度成骨诱导3天后的ALP染色；c) 成骨诱导7天后的ARS染色；d) ALP活性定量分析；e) ARS矿化面积定量分析；f) 成骨相关基因表达的qPCR热图；g–i) RUNX2、BMP2和ACTIN的共聚焦免疫荧光图像；j–o) RUNX2、BMP2和ACTIN阳性面积及荧光强度的定量荧光分析。

（3）转录组学分析揭示细胞骨架-线粒体-成骨调控网络

在5 μg mL⁻¹浓度下对rBMSCs进行转录组学分析以阐明其成骨加速机制。RNA-seq显示各组组内重复性高、组间分离清晰（图3A）；层级聚类显示细胞骨架调控基因（Tagln、Septin家族）及成骨与细胞外基质基因（Spp1、Col1a1）显著上调，未分化相关基因下调（图3B）。KEGG分析显示MAPK、Ras、HIF-1、VEGF、cGMP-PKG及脂肪酸、丙酮酸代谢通路显著富集（图3C）。共鉴定出3291个上调和3002个下调基因（图3D）；GO富集显示肌动蛋白细胞骨架组织及小GTP酶活性相关过程显著富集（图3E）。桑基图显示Rhoa、Sept7、Opa1、Cdc42及线粒体分裂调控因子Dnm1l与上述通路强烈关联（图3F）。PPI网络揭示RUNX2为成骨调控网络的中心枢纽，与Bmp2、Col1a1、Dlx5及细胞骨架调控因子形成密集互作簇（图3G）。GSEA显示细胞骨架组织基因集显著正富集且峰值靠前，代谢通路富集较弱（图3H,I），提示细胞骨架重塑为上游事件，代谢重编程为后续适应。上述结果表明，DEX@LDH/MET顺利获得细胞骨架-线粒体调控轴诱导协同成骨程序。

图3. 转录组学分析揭示DEX@LDH/MET诱导的细胞骨架-线粒体-成骨调控网络。a) RNA-seq样本的Pearson相关性热图；b) 差异表达基因（DEGs）的层级聚类热图；c) DEGs的KEGG通路富集分析；d) 显示上调和下调基因的火山图；e) 按生物学过程、细胞组分和分子功能分类的GO富集分析；f) 说明细胞骨架、线粒体和成骨基因簇之间关系的桑基图；g) 所选成骨和细胞骨架调控因子的PPI网络；h,i) 细胞骨架组织和代谢通路的GSEA富集图。

（4）转录组-代谢组联合分析揭示与线粒体适能相关的代谢重塑

非靶向代谢组学分析用于探究与细胞骨架调控偶联的代谢重编程。热图与PCA显示三组代谢分离清晰（图4A,B）。火山图显示分化对照组较D0有1023种差异代谢物（DEMs），处理组较D0有1026种，处理组较分化对照组仅357种（图4C）；转录组相应组间差异基因分别为5512、5465和37个（图4D），表明DEX@LDH/MET选择性微调特定代谢通路。CCA分析显示基因表达与代谢物丰度高度一致（图4E），氧化还原相关代谢物构成互作网络中心节点（图4F）。Mfuzz聚类显示NADPH、谷胱甘肽中间体进行性下调，GSH、丙酮酸、抗坏血酸持续上调（图4G），提示抗氧化防御增强及线粒体代谢活性提高。Spearman相关性分析（|r|≈1）显示脂质与氨基酸代谢物同细胞骨架基因密切偶联（图4H），NAD⁺代谢产物2-PY显著改变、D-核糖上调。联合通路富集显示氨基酸生物合成、核苷酸代谢等通路与线粒体功能及氧化还原稳态密切相关（图4I）。上述结果表明，DEX@LDH/MET诱导以NAD⁺相关代谢增强、氧化还原平衡改善及细胞骨架-线粒体功能调控为特征的协同重编程，形成"类年轻化"线粒体状态。

图4. 转录组-代谢组联合分析揭示与线粒体适能相关的代谢重塑。a) CTRL_D0、CTRL_D3和DEX@LDH/MET_D3组间显著改变代谢物的热图；b) 代谢组学谱的PCA得分图；c) 差异代谢物（DEMs）的火山图；d) 差异基因（DEGs）的火山图；e) 基因和代谢物数据的CCA载荷图；f) 前20个差异基因与代谢物互作的CCA相关网络；g) 不同组间代谢物丰度谱的Mfuzz聚类分析；h) 前20个差异代谢物及相关组学指标的Spearman相关性弦图；i) 转录组与代谢组联合数据的通路富集分析。

（5）SEPT7驱动的细胞骨架重塑重焕rBMSCs线粒体结构

多组学分析鉴定出SEPT7为连接细胞骨架重塑与线粒体动力学的潜在介导因子。为验证其功能，设置对照（CTRL）、DLM、septin抑制剂FCF及FCF+DLM四组。qPCR和western blot显示DLM处理后SEPT7的mRNA与蛋白水平无变化（图5N,O），而GTP酶活性测定表明SEPT7活性显著增强（图5K），提示DLM顺利获得翻译后激活调控SEPT7。共聚焦显示DLM组SEPT7与Actin共定位明显增加（图5A,B）；DRP1-线粒体共定位分析显示DLM显著减少DRP1向线粒体募集并部分逆转FCF诱导的过度募集（图5C,D）。定量分析表明DLM维持线粒体平均分支长度及footprint（图5G,H）；TEM显示DLM组保留线粒体超微结构与嵴组织，FCF抑制SEPT7后嵴破坏碎裂（图5E）。DLM顺利获得JC-1染色维持线粒体膜电位（图5L,M）并降低胞内ROS水平（图5F,I,J）。第5天ALP与第10天ARS染色证实FCF显著损害成骨分化（图5P）。上述结果提示，SEPT7介导的细胞骨架稳定化作为结构约束，将细胞骨架组织与线粒体动力学偶联，维持线粒体完整性并支持成骨定向。

图5. SEPT7驱动的细胞骨架重塑重焕rBMSCs线粒体结构。a) 不同处理下rBMSCs中SEPT7和Actin的共聚焦免疫荧光图像；b) 荧光强度和共定位分析的定量统计；c) DRP1和线粒体的免疫荧光染色；d) 线粒体DRP1募集的定量分析；e) 线粒体超微结构的TEM图像；f) 细胞内ROS染色；g,h) 线粒体平均长度和面积的定量分析；i,j) ROS强度和阳性面积的定量分析；k) GTP酶活性测定；l) 线粒体膜电位的JC-1染色；m) 红/绿荧光强度的定量统计；n) DRP1、SEPT7和PPARG表达的qPCR分析；o) DRP1、RUNX2和SEPT7蛋白水平的western blot分析；p) 第5天ALP染色和第10天ARS染色。

（6）工程化年轻化线粒体展现可转移的促血管生成活性

采用差速离心自rBMSCs分离工程化线粒体eMITO（图6A）。Janus Green B染色证实其高纯度与结构完整性（图6B），ZetaSizer显示粒径820.5±227.3 nm（图6C）。稳定表达Mito-mScarlet的rBMSCs与MitoTracker Green标记的VECs共培养1、6、24小时，HIS-SIM显示：1小时双色信号分离，6小时红色信号进入VECs线粒体网络，24小时大量VECs线粒体呈红色（图6D），证实线粒体成功转移。荧光标记纯化线粒体共孵育24小时后亦可被VECs有效内化（图6E）。功能实验显示，VECs^eMITO组较VECs组及普通线粒体移植组（VECs^MITO）功能显著增强：划痕实验示侧向迁移加速（图6F,J），Transwell实验示迁移细胞数增加（图6G,K），成管实验示节点数、连接点数、总长度及总分支长度均显著更优（图6I,L–O）。上述结果表明，rBMSCs来源线粒体可被内皮细胞高效内化并显著增强其迁移与血管生成潜能。与常规策略不同，移植前经SEPT7介导的细胞骨架重塑赋予供体线粒体改善的结构完整性与代谢适能。

图6. 工程化年轻化线粒体展现可转移的促血管生成活性。a) 差速离心分离线粒体的示意图；b) 分离线粒体的Janus Green B染色代表性图像；c) 分离线粒体的粒径分布分析；d) HIS-SIM成像的时间依赖性线粒体自rBMSCs向VECs转移；e) 显示VECs内化荧光标记线粒体的共聚焦图像；f) 24小时划痕伤口愈合实验；g) 24小时Transwell迁移实验；h) 线粒体移植入VECs的示意图；i) 线粒体处理4小时后VECs的成管实验；j) 伤口愈合率的定量分析；k) 迁移细胞数量的定量分析；l–o) 成管节点、连接点、总长度和总分支长度的定量分析。

（7）工程化线粒体转移的VECs恢复骨微结构并改善骨质疏松

在卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型中评估工程化线粒体内皮细胞的治疗潜能（图7A）。术后两周Micro-CT证实模型建立：骨小梁稀疏不陆续在，骨密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）显著降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）与BS/BV%增加（图7B,C）。经尾静脉注射不同内皮细胞制剂，于4、8周评估骨再生。三维Micro-CT重建显示VECs^eMITO组骨小梁恢复最显著：8周时形成致密且高度互连的骨小梁网络，优于PBS、VECs及VECs^MITO组（图7D,E），椎体骨结构亦改善（图7L）。定量分析证实：8周后VECs^eMITO组BMD为PBS组的1.69倍，骨体积分数（BV/TV%）第8周达PBS组的1.47倍；Tb.N在VECs^MITO与VECs^eMITO组均显著增加，VECs^eMITO组Tb.Th优于VECs^MITO组且接近假手术组（图7F–K,M,N）。治疗8周后心、肝、脾、肺、肾H&E染色显示各组均无组织病理学异常，证实其体内生物安全性。上述结果突出线粒体工程化内皮细胞在骨质疏松骨修复中的治疗潜力，其机制与线粒体转移诱导的促血管生成效应及血管-骨耦联增强一致。

图7. 工程化线粒体转移的VECs恢复骨微结构并改善骨质疏松。a) OVX模型建立及VECs治疗的实验设计；b) OVX术后6周远端股骨（DF）的Micro-CT图像；c) 假手术和OVX组BMD、Tb.Th、BS/BV%、BV/TV%、Tb.Sp和BS/TV%的定量分析；d) 治疗后远端股骨的三维重建Micro-CT图像；e) 骨小梁微结构的冠状面视图；f–k) 远端股骨BMD、BV/TV%、BS/BV%、Tb.N、BS/TV%和Tb.Th的定量分析；l) 不同治疗组椎体（VB）的代表性Micro-CT图像；m,n) 椎体Tb.Th、Tb.N的定量分析。

（8）工程化线粒体转移的VECs恢复体内血管-骨耦联

治疗8周后行组织学分析以表征工程化线粒体内皮细胞的组织水平再生效应。股骨和椎体切片的H&E、Masson三色及VG染色显示：PBS组骨小梁碎裂伴广泛脂肪细胞浸润，VECs^eMITO组呈致密陆续在的骨小梁结构及排列良好的胶原纤维（图7A,H）。定量分析证实，VECs^eMITO治疗后骨体积分数（CF/TV%）、I型胶原沉积及骨面积/总面积比（BA/TA）均显著增加，接近假手术组水平（图8B,C,E,F,G）。TRAP染色显示PBS与VECs^MITO组TRAP阳性破骨细胞显著增多，VECs^eMITO治疗显著减少TRAP阳性细胞，有效抑制破骨细胞介导的骨吸收（图8D）。免疫荧光显示VECs^eMITO组CD31⁺血管密度显著增加，成骨转录因子RUNX2与成骨信号蛋白BMP2表达同步增强（图8I–K），证实血管生成与成骨的协同激活，与体外线粒体转移介导的血管生成增强一致。上述组织学证据表明，VECs^eMITO顺利获得协调激活血管-成骨耦联恢复骨质疏松小鼠的骨微结构与重塑平衡，支持线粒体驱动的血管再生是其骨骼疗效的关键机制。

图8. 工程化线粒体转移的VECs恢复体内血管-骨耦联。a) 远端股骨（DF）切片的H&E、Masson三色、VG和TRAP染色；b,e) 远端股骨和椎体（VB）胶原纤维面积和骨体积分数（CF/TV%）的定量分析；c,f) 远端股骨和椎体I型胶原纤维面积（%）的定量分析；d) 远端股骨切片中TRAP⁺细胞的定量分析；g) 椎体中骨面积/总面积（BA/TA）比的定量分析；h) 椎体切片的组织学染色；i,j) 远端股骨切片中CD31、RUNX2和BMP2的免疫荧光染色；k) 荧光强度的定量分析。