K8·凯发(中国)

针对上述问题，海南医科大学牛莉娜、邬强、彭雅南教授开发了一种哑铃形DNA纳米递送平台，表面修饰葡萄糖聚合物、光敏剂及营养模拟物L-精氨酸，旨在劫持细菌ABC转运蛋白实现主动内化。该结构借助葡萄糖包层促进转运蛋白介导的入胞，发挥空间局限的光热/光动力杀菌作用。同时，DNA支架热解触发L-精氨酸释放并生成一氧化氮，顺利获得NO/cGMP/PKG通路加速成纤维细胞迁移与血管生成，增强组织修复。在MRSA和MDR-PA混合感染的伤口模型中，该系统显著降低细菌负荷、增加胶原沉积、促进快速愈合，且未见毒性。该策略将细菌防御机制转化为治疗通道，为精准治疗耐药感染给予了多功能平台。该文章于2026年6月4日以《Hijacking of Bacterial ABC Transporters by DNA Nano delivery System to Achieve Synergistic Antibacterial and Tissue Repair》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.76354）。

方案1. DGA-808作为DNA纳米递送系统协同抗菌和组织修复的工作原理示意图。

（1）DNA纳米递送系统的组装与表征

以22核苷酸单链DNA（Dum）为核心支架，经席夫碱反应偶联GP、生物素-链霉亲和素连接B-IR808，并在L-Arg介导下自组装为哑铃形结构（图1A）。理论计算及琼脂糖凝胶电泳（图1B）验证了顺序装载。透射电镜显示DGA-808为高单分散短棒状颗粒，平均直径6.79±1.11 nm，适配ABC转运蛋白内化尺寸（图1C-D）。紫外-可见光谱（图1F）分别于260 nm（DNA）、490 nm（GP的糠醛衍生物）、570 nm（L-Arg茚三酮产物）及635 nm（B-IR808）证实各组分结合。定量显示每3 µM Dum载入GP、L-Arg和B-IR808。表面电荷监测组装每一步变化（图1G），傅里叶变换红外光谱（图1H）出现O-H、C-H、C-N及C=N特征峰，确认组分连接。

图1. Dum-GP-Arg-IR808（DGA-808）的构建与表征。（A）DGA-808组装策略示意图。（B）Dum、DNA-GP（DG）、Dum-GP-A（DGA）以及Dum-GP-A-IR808（DGA-808）的1%琼脂糖凝胶电泳图。（C）DGA-808的透射电子显微镜（TEM）图像。（D）基于透射电镜图像得到的干燥状态下DGA-808的粒径分布。（E）动态光散射（DLS）测得的Dum与DGA-808 的流体力学直径。（F）证明DGA-808成功组装的紫外-可见吸收光谱。（G）Dum、DG、DGA和DGA-808的电位。（H）葡萄糖聚合物（GP）、L-精氨酸（L-Arg）、生物素修饰IR808（B-IR808）与DGA-808的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。

（2）由GP介导的细菌特异性摄取1

葡萄糖聚合物作为靶向配体，引导DGA-808特异性识别细菌。摄取实验显示（图2A、B），DGA-808对MRSA和MDR-PA均产生强烈红色荧光，且与DAPI标记的细菌核酸高度重叠。而无GP配体的对照组（DA-808和游离B-IR808）荧光信号极弱。ImageJ定量分析（图2E、F）证实DGA-808组的相对荧光强度均为100%，对照组不足2%，表明GP介导的高效靶向。时间梯度实验（图2C、D）显示1-4小时内荧光强度逐渐增加。定量分析（图2G、H）表明，MRSA在1、2、3小时的荧光强度分别为15.41%、52.98%、92.78%，MDR-PA为34.33%、67.17%、99.89%；3小时与4小时相比无显著差异，提示细菌对DGA-808的摄取在3小时达到饱和。

图2. DGA-808细菌靶向能力验证。DGA-808、B-IR808与DA-808分别和（A）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、（B）多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）共孵育后的激光共聚焦显微镜（CLSM）图像。DGA-808与（C）MRSA、（D）MDR-PA分别孵育1、2、3、4小时后的激光共聚焦显微镜图像。（E-H）对图（A-D）中各组荧光强度比值的定量统计。

（3）由GP介导的细菌特异性摄取2

内化机制研究中，竞争实验（图3A）显示，不同浓度GP预孵育使MRSA和MDR-PA荧光强度呈浓度依赖性下降，分别由100%降至3.31%和6.98%（图3B、C）。抑制实验（图3D-F）采用NaN3耗竭ATP后，几乎检测不到DGA-808荧光，证实其顺利获得能量依赖型ABC转运蛋白内化。进一步用FITC-氨苄西林评估外排活性，3h可见荧光，4h显著降低，表明抗生素被外排，而DGA-808组4h荧光与3h无显著差异。（图2G、H及图3G-I）。为评估选择性，将DGA-808与L929成纤维细胞共培养，CLSM未见红色荧光（图3J），表明几乎不被哺乳动物摄取，体现对致病菌的高选择性。综合表明，GP将纳米载体伪装为营养物质，欺骗ABC转运蛋白识别内化且不触发外排，预先阻断耐药形成（图3K）。

图3. 顺利获得竞争实验与能量抑制实验探究DGA-808的细菌摄取机制。（A）经不同浓度葡萄糖聚合物（GP）预处理的MRSA或MDR-PA与DGA-808共孵育后的典型激光共聚焦显微镜图像。（B，C）对图（A）中经梯度升高GP浓度处理的MRSA、MDR-PA进行荧光强度定量分析。（D）叠氮化钠（NaN3）预处理后再与DGA-808孵育的MRSA、MDR-PA激光共聚焦显微镜图像。（E，F）对图（D）中MRSA、MDR-PA荧光强度的定量分析。（G）MRSA、MDR-PA与异硫氰酸荧光素标记氨苄西林（FITC-Ampicillin）共孵育的激光共聚焦显微镜图像。（H，I）对图（G）中MRSA、MDR-PA荧光强度的定量分析。（J）L929细胞与DGA-808共孵育后的激光共聚焦显微镜图像。（K）DGA-808在细菌内由ABC转运蛋白介导的内化通路示意图，分别展示（i）正常摄取、（ii）天然底物存在下的竞争性摄取、（iii）转运蛋白阻断后摄取被抑制、（iv）细菌外排泵主动外排抗生素四种情况。

（4）DGA-808的光热诱导程序化响应机制

光照升温实验（图4A）显示DGA-808升温最显著，且经4次循环保持稳定（图4B），根据冷却曲线计算光热转换效率为44.2%（图4C）。在细菌悬液中，不同浓度DGA-808呈现浓度依赖性升温（图4D），30、60、120、180 nM分别升至41.7、53.5、57.4、59.2°C，其中60 nM组接近设计熔点，红外热成像确认达53.5°C（图4E）。L-Arg释放验证（图4G、H）表明50°C时释放量达4.24±0.04 mM，37°C几乎无释放。该热响应过程实现了光热激活、结构解聚与药物可控释放的级联设计（图4F），凸显时空递送潜力。

图4. DGA-808的光热性能及其热触发L-精氨酸释放行为。（A）氙灯照射下磷酸盐缓冲液（PBS）、Dum、DGA、B-IR808、IR808以及DGA-808的温度变化曲线。（B）DGA-808四次照射循环的光热升降温曲线。（C）DGA-808的升降温曲线（黑色），降温时间与温度驱动力负自然对数呈线性关系（红色曲线）。（D）氙灯照射下磷酸盐缓冲液与含有不同浓度DGA-808的细菌悬液温度变化曲线。（E）氙灯照射下磷酸盐缓冲液、DGA-808、细菌悬液的红外热成像图。（F）光热激活后DGA-808热响应释药机制示意图。（G）不同温度下DGA-808释放L-精氨酸的紫外-可见光谱。（H）37摄氏度与50摄氏度条件下DGA-808载药浓度与释药浓度对比。

（5）DGA-808抗菌效力的评价

平板计数（图5A）显示，DGA-808光照组菌落极少，MRSA和MDR-PA存活率分别为1.89±0.44%和0.62±0.17%，显著低于B-IR808（63.31%、48.75%）和DA-808（62.48%、49.74%）（图5B）。SEM观察（图5C）见细胞壁塌陷、穿孔及胞质外溢，活/死染色（图5D）显示DGA-808组红色荧光（死细胞）最强，存活率仅0.18%和1.18%，显著低于对照组（图5E）。ROS检测（图5F）显示DGA-808组绿色荧光最强，定量（图5G）MRSA和MDR-PA ROS水平分别达100%和100%，显著高于B-IR808及DA-808组。DGA-808顺利获得GP靶向及ROS氧化损伤，对革兰氏阳性/阴性耐药菌均具高效杀菌作用。

图5. DGA-808体外抗菌性能与作用机制验证。（A）经磷酸盐缓冲液、B-IR808、DGA、DA-808、DGA-808处理，且分别在氙灯照射/无光照条件下培养的MRSA、MDR-PA菌落平板实拍图。（B）对应图（A）的MRSA（i）、MDR-PA（ii）细菌存活率定量统计。（C）不同处理后MRSA、MDR-PA的扫描电镜（SEM）图像。（D，E）经SYTO9（绿色）与碘化丙啶（PI，红色）活死菌双染的MRSA（D）、MDR-PA（E）激光共聚焦显微镜图像，附带活/死菌比例定量分析。（F）激光照射下，采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针（绿色）标记各组MRSA、MDR-PA胞内活性氧（ROS）的典型激光共聚焦显微镜图像。（G）基于图（F）对MRSA（i）、MDR-PA（ii）的DCFH-DA荧光强度定量分析。

（6）DGA-808在创面感染模型中的治疗有效性验证

建立MRSA小鼠创面感染模型（图6A），选定720 nM浓度。光照下伤口温度升至53.2°C，达DNA解聚阈值（图6C）。陆续在成像及定量（图6B、D）显示DGA-808光照组愈合最快，第9天几乎闭合；细菌平板计数（图6E）示其存活率仅0.89±0.15%，显著低于对照组。治疗期间体重无差异（图6F）。组织学H&E（图6G）示炎症减轻、上皮化明显，Masson三色（图6H）示胶原沉积增加。MDR-PA模型验证广谱性，结果一致。

图6. DGA-808在MRSA感染小鼠伤口模型中的治疗效果评价。（A）小鼠伤口感染模型构建与处理流程示意图。（B）伤口实拍图（i）、伤口愈合进程示意图（ii）、不同处理后感染伤口残留细菌菌落琼脂平板实拍图（iii）。（C）氙灯照射下各组感染伤口的温度变化曲线。（D）各组最终伤口面积定量统计分析。（E）根据不同处理后感染伤口残留菌落计数计算得到的细菌存活率。（F）整个实验周期内小鼠体重变化曲线。（G）处理9天后感染伤口组织的苏木精-伊红（H&E）染色切片。（H）伤口组织Masson染色切片图像。

（7）DGA-808促进修复机制的研究

为探究修复机制，DGA-808在光照下产生活性氧（ROS），将热解聚释放的L-精氨酸非酶氧化为NO（图7A）。Griess法光照组540 nm吸收峰显著，且随照射时间增强，证实NO持续生成（图7B、C）。划痕实验表明，DGA-808光照组24 h和48 h迁移率分别为75.61%和96.88%，显著高于未光照组及对照组图7D-F），Transwell实验亦证实迁移细胞显著增加（图7G、H）。分子层面，DGA-808光照组伤口组织中sGC、PKG及CD31的mRNA和蛋白表达均显著上调（图7I-N），VEGF免疫荧光信号增强（图7O），证实NO激活NO-cGMP-PKG信号轴（图7P）。综上，该平台顺利获得PDT产生的ROS转化L-Arg为NO，进而激活修复通路，实现抗菌与组织再生的时空级联整合。

图7. DGA-808顺利获得活性氧介导光催化L-精氨酸转化为一氧化氮促进血管内皮细胞迁移与组织修复。（A）DGA-808在氙灯照射下产生活性氧，催化L-精氨酸转化为一氧化氮的示意图。（B）采用格里斯试剂检测有无氙灯照射条件下DGA-808生成一氧化氮的紫外-可见光谱。（C）光照/无光照条件下，不同时间点DGA-808与格里斯试剂反应后的显色实拍图。（D）人脐静脉内皮细胞经对照组、DGA-808组、光照DGA-808组处理后，0、24、48小时划痕愈合实拍图，附带（E）24小时、（F）48小时细胞愈合率定量统计。（G）不同处理24小时后人脐静脉内皮细胞Transwell迁移细胞定量统计，（H）对应Transwell实拍图像。（I-K）各组小鼠伤口皮肤组织内可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）、蛋白激酶G（PKG）、CD31的相对mRNA表达水平。（L-N）不同处理小鼠伤口组织中sGC、PKG、CD31的蛋白表达水平及半定量分析。（O）伤口组织切片血管内皮生长因子免疫荧光染色图像米。（P）一氧化氮介导促进内皮细胞增殖与血管新生通路示意图。