K8·凯发(中国)

针对上述问题，天津医科大学何金龙与朱毅教授团队，与天津医科大学第二医院鲍乾坤教授、汕头大学医学院第一附属医院陈业群教授团队首次揭示了E3泛素连接酶TRIM21作为振荡剪切应力（OSS）的关键响应者，在OSS条件下顺利获得液-液相分离增强其与PTPN14的相互作用，介导PTPN14在K956位点的K48连接泛素化降解。PTPN14的降解解除其对YAP信号的抑制，激活VCAM-1等黏附分子的表达，从而驱动内皮炎症反应与动脉粥样硬化形成。基于这一机制，团队顺利获得内皮特异性双基因敲除小鼠模型在体内证实了TRIM21-PTPN14调控轴的功能必要性。这一发现将蛋白质相分离与泛素化降解两大热点领域在血管力学生物学中联通，为理解血流如何驱动血管炎症给予了全新视角。该文章于2026年8月18日以《Phase Separation of TRIM21 Modulates PTPN14 Stability to Drive Flow-Dependent Endothelial Activation and Atherogenesis》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.77262）。

（1）PTPN14蛋白水平与稳定性受不同血流模式调控

鉴于粥样斑块优先形成于暴露于低和/或振荡剪切力的动脉分叉和弯曲处，研究人员第一时间检测了ApoE−/−小鼠主动脉内膜中PTPN14的表达。结果显示，与暴露于低振荡剪切力的主动脉弓（AA）相比，暴露于高单向层流剪切力的胸主动脉（TA）内皮中PTPN14表达显著更高（图1A–C），而其mRNA水平在两区域间并无差异。整体mount免疫荧光染色进一步显示，AA外弯侧和TA的PTPN14水平显著高于AA内弯侧（图1D、E）。喂食高脂饮食8周后，粥样病变内膜区PTPN14表达较正常饮食组显著降低（图1F、G）；人冠状动脉标本中，粥样斑块区PTPN14水平亦明显低于非斑块区（图1H、I）。体外流体剪切实验进一步证实：振荡剪切力（OSS）和脉动剪切力（PSS）均不改变PTPN14 mRNA水平，但OSS显著降低PTPN14蛋白水平（图1J、K）；环己酰亚胺（CHX）追踪实验显示OSS显著缩短PTPN14蛋白半衰期（图1L、M），且蛋白酶体抑制剂MG132可阻断这一调控（图1N）。这些体内外数据共同表明，内皮PTPN14蛋白丰度和稳定性随血流剪切力模式动态调控。

图1. PTPN14蛋白水平与稳定性受不同血流模式调控。(A-C) ApoE−/−小鼠胸主动脉（TA）与主动脉弓（AA）内膜PTPN14表达的代表性免疫印迹（B）及定量（C）；(D,E) 整体mount免疫荧光染色（D）及PTPN14定量（E）；(F,G) 正常饮食（ND）与西方饮食（WD）喂养8周ApoE−/−小鼠主动脉根部PTPN14表达（F）及定量（G）；(H,I) 人冠状动脉粥样硬化（AS）与非粥样（Non-AS）区PTPN14表达（H）及定量（I）；(J,K) HUVECs暴露于OSS或PSS 12 h后PTPN14、VCAM-1及t-eNOS免疫印迹（J）与PTPN14定量（K）；(L,M) CHX处理后PTPN14蛋白稳定性（L）及定量（M）；(N) MG132处理下PTPN14泛素化水平。

（2）内皮特异性PTPN14缺失加重内皮炎症反应与动脉粥样硬化

由于全身性PTPN14敲除小鼠存在生存力缺陷和淋巴水肿等问题，研究人员构建了可诱导的内皮细胞特异性PTPN14敲除小鼠（Ptpn14iECKO）及其同窝对照（Ptpn14fl/fl），并将其与ApoE−/−小鼠杂交。高脂饮食喂养12周后，整体mount油红O染色显示，内皮特异性缺失PTPN14使全主动脉粥样斑块负荷显著增加（图2A、B）；主动脉根部病变面积和脂质沉积也明显增加，而胶原含量无显著变化（图2C、D）。免疫组化分析显示，内皮PTPN14缺失显著增加主动脉根部病变中巨噬细胞（CD68）蓄积，而α-SMA阳性的血管平滑肌细胞（VSMC）面积无明显改变（图2E、F）。两组小鼠体重和血脂谱无显著差异，提示该表型独立于全身代谢因素。此外，内皮PTPN14缺失导致主动脉根部内皮VCAM-1表达显著升高（图2G、H），并伴随YAP活化——表现为YAP Ser127磷酸化减少、Tyr357磷酸化增加（图2I–K）。上述结果表明，内皮特异性PTPN14缺失增强内皮炎症激活并加剧动脉粥样硬化病变开展。

图2. 内皮特异性PTPN14缺失加重内皮炎症反应与动脉粥样硬化。8周龄雄性Ptpn14fl/fl ApoE−/−与Ptpn14iECKO ApoE−/−小鼠高脂饮食喂养12周。(A) 全主动脉整体mount油红O染色代表性图像；(B) 全主动脉病变面积定量；(C) 主动脉根部HE、油红O及Masson三色染色；(D) 病变面积、油红O阳性区及胶原含量定量；(E–K) 主动脉根部CD68、α-SMA、vWF、VCAM-1、p-YAPS127、p-YAPY357免疫荧光染色及定量。

图3. TRIM21与PTPN14结合并介导剪切力诱导的PTPN14降解。(A) Flag-PTPN14亲和纯化联合质谱鉴定相互作用蛋白流程；(B) HEK293T细胞中共表达Flag-PTPN14与Myc-TRIM21的Co-IP验证；(C,D) HUVECs内源性Co-IP；(E,F) PTPN14与TRIM21免疫荧光共定位及荧光强度分析；(G,H) PTPN14与TRIM21截短突变体示意图及结构域定位Co-IP实验；(I) AlphaFold3预测的PTPN14-TRIM21结合界面（R132与D355盐桥）；(J,K) R132A/D355A突变对二者相互作用的影响及定量；(L,M) 敲低TRIM21对不同剪切力下CHX处理的PTPN14蛋白水平的影响及定量。

（4）TRIM21介导PTPN14在赖氨酸956位点的K48连接泛素化

过表达TRIM21显著降低PTPN14蛋白稳定性（图4A），并以剂量依赖方式降低PTPN14蛋白水平，该效应可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断（图4B）。共转染泛素后的免疫沉淀实验显示，TRIM21显著促进PTPN14多聚泛素化，且主要促进K48连接（而非K63连接）的泛素化（图4C）。在内皮细胞中，敲低TRIM21可显著减少OSS条件下PTPN14的总泛素化和K48连接泛素化水平，而PSS条件下无明显影响（图4D）。利用已报道的E3连接酶失活突变体（C16A、C31A、H33W），研究人员证实TRIM21的E3连接酶活性对PTPN14泛素化必不可少（图4E）。顺利获得PhosphoSitePlus和qPTM数据库预测交集，筛选出4个高度保守的候选泛素化位点（K6、K18、K509、K956）（图4F、G）；赖氨酸-精氨酸点突变实验显示，仅K956R突变能显著削弱TRIM21诱导的PTPN14泛素化（图4H、I）。综上，TRIM21顺利获得其SPRY结构域结合PTPN14的FERM结构域（R132-D355界面），催化PTPN14在K956位点发生K48连接多聚泛素化，进而经蛋白酶体途径降解（图4J）。

图4. TRIM21介导PTPN14泛素化与降解。(A) 过表达TRIM21对PTPN14蛋白稳定性的影响（CHX追踪）；(B) 梯度剂量TRIM21对PTPN14水平的影响及MG132的阻断作用；(C) TRIM21促进PTPN14 K48连接（而非K63连接）泛素化；(D) 敲低TRIM21对OSS/PSS下PTPN14总泛素化及K48连接泛素化的影响；(E) E3连接酶失活突变体（TRIM21-LD）对泛素化的影响；(F) PhosphoSitePlus与qPTM数据库预测位点交集（K6、K18、K509、K956）；(G) 人、鼠、牛PTPN14候选位点序列比对；(H,I) 各赖氨酸突变体泛素化水平及定量；(J) 机制示意图：TRIM21经R132/D355界面结合PTPN14，催化K956位点K48连接泛素化并经蛋白酶体降解。

（5）TRIM21发生血流模式依赖的相分离并与PTPN14形成共凝聚体

值得注意的是，不同血流条件并未改变TRIM21的蛋白水平，但免疫荧光显示TRIM21在内皮细胞胞质中呈明显的点状分布，且OSS以时间依赖方式（刺激6 h起）增加TRIM21凝聚体数量，而PSS长时间处理则无此效应（图5A、B）；ApoE−/−小鼠整体mount染色亦显示TRIM21凝聚体在动脉粥样硬化好发的AA区显著富集。删除卷曲螺旋（CC）结构域可完全消除OSS诱导的TRIM21凝聚体形成。活细胞延时成像显示mCherry-TRIM21点状结构发生动态融合与分裂，符合液滴特性；1,6-己二醇（1,6-HD）可溶解这些凝聚体，而阴性对照2,5-己二醇无此效应（图5C–E），证实TRIM21在内皮细胞中发生液-液相分离（LLPS）。利用OptoDroplet光控系统，研究人员发现与PSS相比，蓝光可在OSS条件下更强烈地诱导TRIM21液滴形成；而细胞松弛素D（Cyto D）破坏肌动蛋白骨架后，蓝光诱导的液滴形成显著增强（图5F–H），提示细胞骨架重排调控TRIM21的相分离行为。最后，邻近连接测定（PLA）显示OSS显著增强TRIM21与PTPN14的空间邻近性，而该效应可被1,6-HD消除（图5I、J），表明TRIM21相分离促进了二者的相互作用。综上，TRIM21以内皮细胞骨架依赖的方式发生血流模式依赖的LLPS，促进PTPN14的募集与降解。

图5. TRIM21发生血流模式依赖的相分离并与PTPN14形成共凝聚体。(A,B) OSS/PSS处理不同时间后TRIM21免疫荧光及凝聚体数量定量；(C) mCherry-TRIM21点状结构融合与分裂的延时成像；(D,E) 1,6-HD/2,5-HD处理对mCherry-TRIM21凝聚体的影响及定量；(F) OptoDroplet系统示意图；(G,H) 不同剪切力及Cyto D处理后蓝光诱导的Opto-TRIM21液滴形成及定量；(I,J) 原位PLA检测TRIM21-PTPN14相互作用及定量。

（6）内皮特异性TRIM21缺失减轻内皮炎症与动脉粥样硬化

体外实验中，敲低TRIM21显著抑制OSS诱导的VCAM-1、ICAM-1、SELE和MCP-1等多种促炎基因mRNA表达（图6A）。体内研究方面，研究人员构建了可诱导的内皮细胞特异性TRIM21敲除小鼠（Trim21iECKO）并与Ldlr−/−小鼠杂交（因Trim21与ApoE同位于小鼠7号染色体，故选用Ldlr−/−背景）。高脂饮食喂养12周后，整体mount油红O染色显示，内皮特异性缺失TRIM21使全主动脉病变面积显著减少（图6B、C）；主动脉根部病变面积、脂质蓄积和巨噬细胞浸润均显著降低，而VSMC含量和胶原沉积增加（图6D–G）；免疫荧光显示主动脉根部内皮VCAM-1表达显著下调（图6H、I），而PTPN14水平上调。两组小鼠体重及血脂谱无显著差异。上述结果表明，内皮特异性TRIM21缺失可减轻内皮炎症激活并发挥抗动脉粥样硬化作用。

图6. 内皮TRIM21缺失减轻扰动流诱导的动脉粥样硬化。(A) 敲低TRIM21对OSS/PSS下VCAM-1、ICAM-1、SELE、MCP-1 mRNA表达的影响；(B,C) Trim21fl/fl Ldlr−/−与Trim21iECKO Ldlr−/−小鼠全主动脉整体mount油红O染色及病变面积定量；(D) 主动脉根部HE、油红O及Masson染色；(E) 病变面积、油红O阳性区及胶原含量定量；(F,G) CD68、α-SMA免疫荧光及定量；(H,I) VCAM-1免疫荧光及定量。

（7）内皮PTPN14缺失削弱TRIM21缺失的抗动脉粥样硬化效应

为确证TRIM21-PTPN14调控轴在动脉粥样硬化中的功能必要性，研究人员构建了内皮细胞特异性PTPN14/TRIM21双敲除小鼠，经尾静脉注射AAV-PCSK9D377Y诱导高脂血症后，高脂饮食喂养12周。结果显示，与对照组相比，内皮PTPN14缺失显著增加全主动脉病变面积（图7A、B）；而PTPN14缺失背景下同时敲除TRIM21并不能进一步改善表型——双敲组与PTPN14单敲组病变面积相当（图7A、B），表明TRIM21缺失的保护作用在PTPN14缺失时被基本废除。主动脉根部组织学分析进一步证实：双敲组与PTPN14单敲组的病变面积、脂质蓄积及胶原沉积无显著差异（图7C、D）；巨噬细胞浸润与VSMC含量亦无明显改变（图7E、F）；PTPN14缺失显著升高的内皮VCAM-1表达，不被联合TRIM21敲除所逆转（图7G、H）。各组体重及血脂水平相当。这些体内证据表明，TRIM21的抗动脉粥样硬化效应依赖于其对PTPN14的调控，确立了TRIM21-PTPN14轴在内皮激活与动脉粥样硬化中的功能性通路地位。

图7. 内皮PTPN14缺失削弱TRIM21缺失的抗动脉粥样硬化效应。8周龄雄性Ptpn14fl/fl、Ptpn14iECKO及Ptpn14iECKO Trim21iECKO小鼠经AAV-PCSK9D377Y处理并高脂饮食喂养12周。(A) 全主动脉整体mount油红O染色代表性图像；(B) 全主动脉病变面积定量；(C) 主动脉根部HE、油红O及Masson染色；(D) 病变面积、油红O阳性区及胶原含量定量；(E,F) CD68、α-SMA免疫荧光及定量；(G,H) VCAM-1免疫荧光及定量。