K8·凯发(中国)

针对上述问题，空军军医大学唐都医院招明高、杨乐团队联合西北工业大学李志梅团队构建了一种一氧化氮（NO）驱动的纳米马达GFS@CAF。研究人员第一时间顺利获得葡萄糖氧化酶（GOx）、Fe³⁺与索拉非尼的配位自组装取得铁死亡诱导核心GFS，随后利用含β-环糊精脂质（βCD-C14）、DSPE-PEG-Arg和叶酸修饰脂质的脂质体进行包载。肿瘤微环境中的H₂O₂可促进L-精氨酸产生NO，为纳米马达给予自驱动并增强深部渗透；进入肿瘤细胞后，GFS在酸性环境中释放GOx、Fe²⁺/Fe³⁺和索拉非尼，顺利获得H₂O₂放大、Fenton反应、GSH耗竭和GPX4失活促进脂质过氧化并诱导免疫原性铁死亡。与此同时，膜锚定βCD捕获并耗竭胆固醇，使肿瘤细胞变硬，进一步增强细胞毒性T淋巴细胞的机械杀伤。该文章于2026年7月29日以《Nitric-oxide propelled nanomotors sensitize tumors to ferroptosis immunotherapy via cholesterol depletion-induced tumor cells stiffening》在线发表于《Materials Today Bio》（DOI：10.1016/j.mtbio.2026.103507）。

示意图：GFS@CAF 纳米马达的 (a) 制备、(b) 推进，以及 (c) 顺利获得使肿瘤细胞硬化实现的铁死亡免疫治疗。

（1）GFS@CAF纳米马达的构建与理化表征

GOx经GSH处理后暴露的巯基与蛋白羧基、氨基同Fe³⁺配位，并与索拉非尼自组装成GFS。GFS呈单分散球形，粒径58.07 nm（图1a、b），Zeta电位由−31.29 mV升至+25.57 mV（图1c），UV-Vis含GOx 280 nm与索拉非尼260 nm特征峰（图1d）。XPS检测到Fe、F、O、N、C元素（图1e），Fe 2p证实Fe²⁺/Fe³⁺共存（图1f）；pH 5.5下GFS解离，粒径呈多宽分布，具酸响应解组装特性（图1g）。GFS经微流控包载于βCD-C14/DSPE-PEG-Arg/DMPC/DSPE-PEG/DSPE-PEG-FA体系（摩尔比30:20:46:3.5:0.5，图1h），得球形GFS@CAF，GFS位于脂质颗粒内部（图1i），粒径132.64 nm、PDI 0.151、Zeta电位−15.94 mV（图1b、c）。RhB吸收峰随GFS@CAF浓度升高而变化，证实βCD-C14整合于其中（图1j）；胆固醇置换RhB致吸收峰蓝移，证实其可捕获胆固醇（图1k）。GFS@CAF在PBS中稳定15 d，含10% FBS的PBS中稳定30 d（图1l）。

图1. GFS@CAF纳米马达的制备与理化表征。（a）GFS的TEM图像；（b） GOx、GFS和GFS@CAF的水合粒径分布；（c） GOx、GFS和GFS@CAF的Zeta电位；（d）GOx、索拉非尼、FeCl₃和GFS的UV-Vis吸收光谱；（e）GFS的XPS全谱；（f） GFS中Fe 2p的高分辨XPS分峰谱；（g） GFS在pH 5.5条件下处理后的TEM图像及水合粒径分布；（h） GFS@CAF各脂质组分的摩尔配比；（i） GFS@CAF的TEM图像；（j）不同浓度GFS@CAF与RhB混合后的UV-Vis吸收光谱；（k）加入胆固醇前后GFS@CAF-RhB复合体系的UV-Vis吸收光谱；（l） GFS@CAF在PBS及含10% FBS的PBS中的粒径和PDI稳定性。

（2）NO驱动运动、趋化与肿瘤深部渗透

GFS@CAF表面的L-精氨酸可响应ROS生成NO。在100 μM H₂O₂条件下，NO释放量随时间持续升高，而缺少DSPE-PEG-Arg的GFS@CF几乎不产生NO，证实L-Arg赋予其响应性NO生成能力（图2a）。NO作为推进动力，其运动行为随H₂O₂浓度升高而增强：运动轨迹范围扩大（图2b），Δt = 3 s时MSD由无H₂O₂时的1.16 μm²升至10 mM H₂O₂下的10.48 μm²（图2c），有效扩散系数亦相应增加（图2d）。

Y型微流道模型中，Hepa1-6细胞裂解液侧形成更高ROS水平（图2e）。在梯度驱动下，GFS@CAF向肿瘤侧迁移，该侧荧光信号随时间增强，120 min时显著高于HL7702细胞裂解液侧，证实其沿ROS梯度的趋化能力（图2f、g）。三维多细胞肿瘤球中，GFS@CAF在各深度的荧光信号均强于非运动型GFS@CF，表明NO驱动促进其向肿瘤深部渗透（图2h）。

细胞摄取方面，Cy5.5标记的GFS@CAF在Hepa1-6细胞中的荧光信号随孵育时间延长而增强（图2i），并与溶酶体探针明显共定位，提示经内吞进入溶酶体（图2j）。内吞机制分析显示，低温、阿米洛利和MβCD处理均降低摄取，氯丙嗪抑制最显著，表明其经网格蛋白介导内吞进入Hepa1-6细胞（图2k）。流式结果显示，GFS@CAF在Hepa1-6和4T1肿瘤细胞中的荧光信号明显高于HL7702正常肝细胞（图2l），CLSM结果进一步验证其肿瘤细胞选择性摄取能力（图2m）。

图2. GFS@CAF的运动、趋化、深部渗透、细胞摄取及肿瘤细胞靶向能力。 （a） GFS@CAF和缺少DSPE-PEG-Arg的GFS@CF在100 μM H₂O₂条件下的NO释放曲线；（b） GFS@CAF在不同H₂O₂浓度条件下的代表性运动轨迹；（c） GFS@CAF在不同H₂O₂浓度条件下的均方位移（MSD）曲线；（d）GFS@CAF在不同H₂O₂浓度条件下的有效扩散系数；（e） Y形微流道中利用细胞裂解液建立ROS浓度梯度并评价GFS@CAF趋化运动的示意图；（f） GFS@CAF加入Y形微流道后不同时间点两侧腔室的荧光图像；（g） Y形微流道两侧腔室在不同时间点的GFS@CAF荧光强度定量；（h） GFS@CAF与非运动型GFS@CF在三维多细胞肿瘤球不同深度的CLSM图像；（i） Hepa1-6细胞在不同孵育时间下摄取Cy5.5标记GFS@CAF的流式分析；（j） Cy5.5标记GFS@CAF在Hepa1-6细胞中的摄取及溶酶体共定位CLSM图像；（k）不同内吞抑制条件下Hepa1-6细胞摄取GFS@CAF的流式分析；（l） Hepa1-6、4T1和HL7702细胞摄取Cy5.5标记GFS@CAF的流式分析；（m） Hepa1-6、4T1和HL7702细胞摄取Cy5.5标记GFS@CAF的CLSM图像。

（3）胆固醇耗竭使肿瘤细胞硬化并增强T细胞杀伤

肿瘤细胞与正常细胞相比呈胆固醇富集特征：Hepa1-6和4T1细胞的胆固醇含量均明显高于HL7702正常肝细胞，其中4T1细胞水平更高（图3a）；荷瘤小鼠中，两种肿瘤组织的胆固醇显著高于邻近肌肉组织，Hepa1-6肿瘤组织约为肌肉组织的6倍（图3b）。含βCD-C14的CAF可调控肿瘤细胞膜胆固醇：对Hepa1-6细胞胞内胆固醇影响较小，但将膜胆固醇降至初始水平的约44.16%，效果与游离βCD相近（图3c）；4T1细胞中也降至约42.33%，表明CAF可高效选择性耗竭肿瘤细胞膜胆固醇（图3d）。Filipin染色显示，βCD和CAF处理后Hepa1-6细胞蓝色荧光减弱、平均荧光强度显著低于PBS组，验证其胆固醇清除能力（图3e）。

AFM纳米压痕结果显示，βCD和CAF处理使Hepa1-6细胞皮质刚度相对PBS组分别提高约1.85倍和1.80倍，4T1细胞出现类似硬化现象，表明耗竭膜胆固醇可有效提高肿瘤细胞刚度（图3f、g）。功能层面，经PBS、βCD或CAF预处理的Hepa1-6和4T1细胞与CD8⁺ T细胞（CTLL-2）共培养后，βCD和CAF组IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞水平升高，证实胆固醇耗竭及肿瘤细胞硬化可增强T细胞效应功能（图3h）。杀伤实验显示，共培养后Hepa1-6细胞活力由PBS组的约100.10%分别降至βCD组的约31.13%和CAF组的约59.11%，表明膜胆固醇耗竭显著提高肿瘤细胞对T细胞攻击的敏感性；4T1细胞响应较弱，提示不同肿瘤细胞对T细胞免疫攻击的敏感性存在差异（图3i）。

图3. GFS@CAF顺利获得耗竭膜胆固醇提高肿瘤细胞刚度并增强T细胞介导的细胞毒性。（a） Hepa1-6、4T1和HL7702细胞中的胆固醇水平；（b）Hepa1-6和4T1肿瘤组织及其邻近肌肉组织中的胆固醇水平；（c） PBS、βCD和CAF处理后Hepa1-6细胞的胞内胆固醇及细胞膜胆固醇相对水平；（d） PBS、βCD和CAF处理后4T1细胞的胞内胆固醇及细胞膜胆固醇相对水平； （e） 不同处理后Hepa1-6细胞的Filipin胆固醇荧光染色图像及平均荧光强度定量；（f） 利用原子力显微镜测定单细胞皮质刚度的示意图；（g） AFM纳米压痕测定不同处理后Hepa1-6和4T1细胞的相对刚度；（h） CTLL-2细胞与经不同处理的Hepa1-6或4T1细胞共培养后IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞比例的流式定量；（i） CTLL-2细胞与经不同处理的Hepa1-6或4T1细胞共培养后的T细胞介导肿瘤细胞杀伤效果。

（4）GFS@CAF诱导铁死亡并触发免疫原性细胞死亡

不同制剂对Hepa1-6细胞的杀伤作用存在差异：与PBS组相比，各处理组均不同程度降低细胞活力，其中GFS和GFS@CAF组下降最为明显，表明GOx、Fe离子与索拉非尼的协同作用增强肿瘤杀伤（图4a）。Annexin V-FITC/PI流式结果显示，PBS组细胞死亡比例仅0.15%，索拉非尼、GFS、CAF和GFS@CAF组分别升至15.8%、21.4%、12.9%和22.1%，GFS@CAF组诱导细胞死亡能力最强（图4b）。

铁死亡机制层面，GFS和GFS@CAF显著降低胞内GSH，其中GFS@CAF组耗竭最明显（图4c），同时升高胞内Fe²⁺水平（图4d），明显降低胞内ATP（图4e），并放大胞内氧化应激，ROS水平显著升高（图4f）。BODIPY 581/591 C11探针检测显示，GFS和GFS@CAF处理后氧化态绿色荧光增强，GFS@CAF组脂质过氧化信号最显著（图4g）；索拉非尼、GFS和GFS@CAF均可抑制GPX4活性（图4h），并促进脂质过氧化物积累，GFS@CAF组LPO水平最高，表明胆固醇调控与氧化损伤共同增强铁死亡（图4i）。

铁死亡进一步诱导免疫原性细胞死亡：GFS和GFS@CAF处理增强Hepa1-6细胞表面CRT暴露，GFS@CAF组信号最强（图4j）；促进HMGB1释放（图4k）并升高胞外ATP水平（图4l），呈现典型的免疫原性细胞死亡信号。

图4. GFS@CAF诱导肿瘤细胞铁死亡并触发免疫原性细胞死亡。（a） Hepa1-6细胞经PBS、索拉非尼、GFS、CAF和GFS@CAF处理24 h后的细胞活力；（b） 不同处理后Hepa1-6细胞Annexin V-FITC/PI凋亡流式分析；（c） 不同处理后Hepa1-6细胞内GSH水平；（d） 不同处理后Hepa1-6细胞内Fe²⁺探针荧光强度；（e） 不同处理后Hepa1-6细胞内ATP水平；（f）不同处理后Hepa1-6细胞内ROS探针CM-H2DCFDA荧光强度；（g） 不同处理后Hepa1-6细胞的BODIPY 581/591 C11脂质过氧化荧光图像；（h） 不同处理后Hepa1-6细胞内GPX4活性；（i） 不同处理后Hepa1-6细胞的脂质过氧化物（LPO）水平；（j） 不同处理后Hepa1-6细胞表面CRT暴露的CLSM图像；（k）不同处理后Hepa1-6细胞培养上清中的HMGB1水平；（l） 不同处理后Hepa1-6细胞培养上清中的ATP释放水平。

（5）GFS@CAF在体内耗竭胆固醇并激活抗肿瘤免疫

体内肿瘤靶向评价显示，静脉注射Cy5.5标记材料后，与缺少叶酸修饰的GFS@CA相比，GFS@CAF在Hepa1-6肿瘤区域呈现更强且更持久的荧光信号，约24 h达到较高水平，且各主要时间点的肿瘤蓄积均高于GFS@CA，表明叶酸修饰提高材料的肿瘤富集与滞留能力（图5a、b）。

在Hepa1-6皮下荷瘤小鼠中，GFS@CAF经GFS诱导铁死亡，同时利用βCD耗竭膜胆固醇并提高肿瘤细胞刚度，协同增强T细胞介导的抗肿瘤杀伤（图5c、d）。Filipin染色及定量结果显示，CAF和GFS@CAF组肿瘤胆固醇荧光明显减弱、信号最低，证实其体内胆固醇耗竭能力（图5e、f）；GPX4免疫荧光及定量结果显示，GFS和GFS@CAF组肿瘤组织GPX4信号明显降低，GFS@CAF组最低，提示其促进体内铁死亡相关抗氧化防御失活（图5g、h）。

免疫原性细胞死亡检测显示，GFS@CAF组肿瘤组织CRT暴露及荧光定量均高于其他治疗组，说明增强的铁死亡进一步促进体内免疫原性细胞死亡（图5i、j）。流式结果显示，GFS和CAF均可提高肿瘤内CD86⁺成熟DC水平，GFS@CAF组最明显（图5k、l）；同时GFS@CAF组肿瘤浸润CD8⁺ T细胞比例最高，表明胆固醇耗竭与铁死亡诱导协同增强细胞毒性T细胞介导的抗肿瘤免疫（图5m、n）。

图5. GFS@CAF的体内分布、肿瘤胆固醇耗竭及抗肿瘤免疫激活。（a）Hepa1-6皮下荷瘤小鼠静脉注射Cy5.5标记GFS@CAF或非FA靶向GFS@CA后的近红外活体荧光图像；（b） 不同时间点Hepa1-6肿瘤区域的相对荧光强度；（c） Hepa1-6皮下荷瘤小鼠的给药及取材分析流程；（d） GFS@CAF顺利获得诱导铁死亡和硬化肿瘤细胞增敏铁死亡免疫治疗的机制示意图；（e）不同治疗后肿瘤组织的Filipin胆固醇荧光染色图像；（f） 不同治疗后肿瘤组织Filipin荧光强度定量；（g） 不同治疗后肿瘤组织的GPX4免疫荧光染色图像；（h） 不同治疗后肿瘤组织GPX4荧光强度定量；（i）不同治疗后肿瘤组织的CRT免疫荧光染色图像；（j） 不同治疗后肿瘤组织CRT荧光强度定量；（k）不同治疗后肿瘤内CD45⁺CD11c⁺细胞中CD86表达的代表性流式图；（l） 不同治疗后肿瘤内成熟DC细胞比例的统计结果；（m） 不同治疗后肿瘤内CD45⁺CD3⁺细胞中CD8⁺ T细胞的代表性流式图；（n） 不同治疗后肿瘤内CD8⁺ T细胞比例的统计结果。

（6）GFS@CAF抑制肿瘤生长并建立长期免疫记忆

GFS@CAF的体内抗肿瘤效果在Hepa1-6皮下荷瘤小鼠中评价。荷瘤小鼠于第0、2、4、6和8天接受不同制剂静脉注射，持续监测肿瘤生长及生存情况（图6a）。肿瘤生长曲线显示，索拉非尼仅产生有限的肿瘤抑制作用，GFS和CAF均可一定程度延缓肿瘤生长，GFS@CAF组抑制效果最显著，治疗期间肿瘤体积基本维持在较低水平（图6b）；个体肿瘤生长轨迹显示，Control、索拉非尼、GFS和CAF组肿瘤均随时间持续增大，而GFS@CAF组多数小鼠肿瘤生长明显受抑，部分个体出现肿瘤缩小（图6c）。肿瘤组织染色显示，GFS@CAF组肿瘤组织结构明显破坏，Ki67增殖信号显著降低、TUNEL阳性信号增加，证实其抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞死亡（图6d）。

治疗期间各组小鼠体重均保持相对稳定，未出现明显持续性下降，初步表明各制剂具有较好的体内耐受性（图6e）。生存分析显示，Control、索拉非尼、GFS和CAF组小鼠均于约20–35 d内陆续死亡，而GFS@CAF显著延长生存期，至第60天仍有5/6只小鼠存活，生存率达83.3%（图6f）。脾脏CD3⁺CD8⁺ T细胞中CD44^high^CD62L^low^记忆T细胞比例由PBS组的48.1%逐步升至GFS组的54.7%、CAF组的55.3%和GFS@CAF组的63.7%，其中GFS@CAF组最高，提示其促进持久性抗肿瘤免疫记忆建立（图6g）。血清生化检测显示，各治疗组白蛋白、ALT、尿素、尿酸、总胆固醇、甘油三酯及血糖等指标总体无明显异常，提示未造成显著系统性生化毒性（图6h）；主要脏器H&E染色显示，GFS@CAF治疗后心、肝、脾、肺和肾均未观察到明显组织学损伤，进一步支持其良好的初步体内生物安全性（图6i）。

图6. GFS@CAF的体内抗肿瘤疗效、免疫记忆及初步生物安全性评价。 （a） Hepa1-6皮下荷瘤小鼠的治疗时间轴；（b） 不同治疗组小鼠相对肿瘤体积随时间的变化；（c） 各治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间的变化；（d） 不同治疗组肿瘤组织的H&E、Ki67和TUNEL染色图像；（e） 不同治疗组小鼠治疗期间的体重变化；（f） 不同治疗组小鼠的生存曲线；（g）不同治疗组小鼠脾脏CD3⁺CD8⁺ T细胞中记忆T细胞的代表性流式分析；（h） 不同治疗组小鼠治疗后的血清生化指标；（i） 不同治疗组小鼠心、肝、脾、肺和肾主要脏器的H&E染色图像。